Способ получения холестеролэстеразы

1395671 хХолестерололеат +Н О Холестерин + Олеиновая кислота холестеролоксидазаХолестерин +О Холестенон Ф +Н О Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения фермента холестеролэстеразы из микроорганизмов, который может быть использован в аналитических системах для диагностических целей в медицине.Цель изобретения - повышение фер,ментативной активности холестеролэсте 10 разы в культуральной жидкости и сокращение времени культивирования,Сущность изобретения заключается н том, что культивирование микроорганизма Рвецйошопав шепдосхпа ЦМПМ 15В осуществляют на оптимизированОб активности холестеролэстеразысудят по скорости увеличения концентрации НО . Электрохимическое окисление Н 0 на платиновом электродепри 0,6 В относительно Ая/АяС 1 электрода сравнения генерирует анодныйток, Скорость увеличения анодноготока пропорциональна скорости образования НО ,которая пропорциональнаскорости гидролиэа холестерололеата,т,е. пропорциональна активности холестеролэстеразы. Угол кинетическойкривой отражает скорость гидролизахолестерололеата и тем самым активность холестеролэстеразы.Максимальная активность холестеролэстеразы в среде культивированиядостигается к 54-му ч роста и равна135 ед/л. После осаждения сульфатомаммония активность полученного фермента"сырца состанляет 900 ед/л. 45Полученный таким образом препаратхолестеролэстераэы сохраняет активоность в течение 1-2 мес при +4 С.П р и м е р 1. Лабораторный способ получения холестеролэстеразы путем культивирования штамма РвеМошопав щеМосЫа ЦМПМ В,Способ включает следующие этапы:поддерживание культуры в пробирках,приготовление посевного материала впробирках,культивированиепродуцентав колбах,осаждение холестеролэстеразыиз культуральной жидкости, определение активности фермента,ной жидкой питательной среде, содержащей глюкозу, минеральные соли, индуктор, н состав которой вводят н качестве источника азота- нитрат натрия, а в качестве индуктора - кукурузное масло и соевую муку.Активность полученной холестеролэстеразы определяют электрохимическим методом,. нключающим взаимодействие фермента с субстратом - хо- . лестерололеатом в фосфатном буфере в присутствии холестеролоксидазы. Определение активности проводят в соответствии со следующей схемой последовательных реакций:олестеролэстеразаь Поддерживание культуры Рвецоошо" пав шепйосЫа ЦМПМ Ви приготовление посевного материалаКультуру поддерживают на столбиках 0,57-ного мясопептонного агара под 2-3 мл слоем стерильного вазелинового масла, В этих условиях продуцент при комнатной температуре может храниться без пересевов н течение нескольких лет, Для повседневной работы бактерии нысевают из-под вазе" линового масла на столбики 0,57-ного мясопептонного агара, на которых культура без пересевон может хранить-., ся при комнатной температуре до 1 мес. Для культивирования в колбах бактерии пересевают с рабочего столбика на скошенный мясопептонный агар. Культуру продуцента выращивают в термостате при 27 С в течение 24 ч, затем ее смывают с агара жидкой питательной средой, на которой в дальнейшем проводят культивирование. Полученная суспензия служит посевным материалом для выращивания продуцента холестеролэстеразы в колбах,Продуцент культивируют в колбах на среде следующего состава, г/л:Глюкоза 3,0МаИО 2,0КНРО 4 1,0МдЗО 7 Н О 0,5КС 1 0,5Соевая мука 20,0Вода ОстальноеКукурузноемасло 4,0рн 7,6Для получения среды укаэанногосостава отдельно готовят 6 Х-ньй раствор глюкозы и 17.-ный раствор Мф 04 х7 Н О. Эти растворы отдельно стерилизуют при 0,5 и 1,0 атм соответственно в течение 20 мин. Параллельно го" 10товят 900 мл раствора, содержащегоостальные компоненты в указанныхсоотношениях. С помощью 1 н,раствораМаОН доводят рН приготовленной средыдо 7,6, которую разливают в колбы 15емкостью 750 мл до 90 мп и стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин. Непосредственно перед засевом в каждую колбу стерильно добавляют по 5 мпраствора глюкозы и сернокислого магния. Засев проводят, добавляя в каждую колбу по 3 мл суспензии 24-часо"вой культуры Рзеойошопаз шепооснаЦМПМ В. Бактерии выращивают вусловиях аэрации на круговой качалке 25(200 об/мин) при 27 С в течение 5060 ч. Фильтрат полученной таким образом культура ьной жидкости содержит холестеролэстеразу с активностью135 ед/л,30Осаждение холестеролэстеразы иэсреды культивирования.Культуральную жидкость отделяютот клеток центрифугированием прио+5 С на центрифуге ЦВРпри 10000об/мин в течение 10 мин. Надосадоч 35ную жидкость оставляют, а осадок удаляют. К надосядочной жидкости порциями при постоянном перемешивании иотемпературе +4 С добавляют перекристаллизованный измельченный сульфатаммония до конечной концентрации507. и оставляют стоять в холодильниоке 1-2 ч при +5 С, Появившийся осадокотделяют центрифугированием при техже условиях, Надосадочную жидкостьудаляют, Полученный осадок суспендируют в минимальном количестве 0,05 МФосфатного буфера, рН 7,0, и проводятдиализ против того же буфера в течение 20-24 ч,Определение активности холестеролэстеразы. А ед/мл = .а2нА/мин.,1 210 Э 1000где нА/мин- р 10 -1,2 -Получают За единицу активности холестеролэстеразы принимают количество фермен ,та, катализирующее отшепление от холестерололеата 1 мкмоль холестерина в мин. Для определения активности фермента применяют следующие растворы:фосфатный буфер 0,05 М, рН 7,0; субстрат - холестерололеат 0,1 М в 102-ном Ттдйоп х 100;холестеролоксидаза - с активностью 17 ед/мп;азид натрия 0,1 М - для инактивации возможно присутствующей катализы;исследуемая проба, разбавленная до активности 150 ед/л.В измерительную ячейку, содержащую 1 мл буферного раствора 1 вводят 0,05 мл раствора 2, 0,02 мл раствора 3, 0,02 мл раствора 4, Через 1-2 мин реакцию инициируют добавлением 0,1 мп раствора 5, Измеряют ток и проводят расчет активности по Формуле изменение тока;степень разбавленияисследуемой пробы;степень разбавления исследуемой пробы в ячейке;коэффициент, равный кон-.центрации холестеринав мкМ, которая способствует изменению тока вячейке на 1 нА /6/ 1 210 8А = --- 19 40 9 ед/мп1000Ф Активность полученного препаратахолестеролэстеразы равна 900 ед/л. П р и м е р 2. Определение зависимости активности холестеролэстеразы (ХЭ) от источника азота, концентрации глюкозы и минеральных солей, природы индуктора и его концентрации.Для определения зависимости активности холестеролэстеразы в культу- ральной жидкости от источника азота за основу берут среду следующего состава, г/л; соевая мука 20; глюкоза 3,01 К НРОд 1,0; КС 1 0,5; МАЗО, 7001 05 рН 7,6,Зависимость активности холестеролэстеразы от источника азота следующая:/л Иэ табл положител испольэов о более высокийдостигается примуки в сочетании ицы видно ч ный эИ 1 ект нии соевойым масломЭ составля Кукурузномасло,4 с кукурузлученной тивность и 135 ед/л),6,При всех указанных в таблице кон центрациях глюкозы и минеральных солей обеспечивается активность полученной ХЭ в культуральной жидкости выюе, чем по прототипу (15-60 вместо 11 ед/л).Для определения зависимости активности холестеролэстеразы от природы индуктора эа основу берут среду следующего состава, г/л: глюкоза 10,0 НаНО, 2,01 К НР 04 1,0; КС 1 0,5 М, МдБОя 7 Н 0 0,5; рН 7,6.Полученные данные приведены в табл.2. Наиболее эффективным источникомазота является НаНОэ. 5 Для определения зависимости активности холестеролэстеразы в культу- ральной жидкости от концентрации глюкозы и минеральных солей эа основу берут среду следующего состава, г/л; 0соевая мука 20; глюкоэа 3,0; НаНО 20 К НР 04 1,0 а КС 1 05 Мд 804 7 НОРезультаты приведены в табл,1. Соевая мука,20+подсолнечноемасло 20+4 651395671 Кукурузное масло Соевая мука 15 АктивКонцент- Актирация, иостг/л ХЗ,ед/л онцентация.Король акаэ 2468/27 52 Подписно ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий1 13035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород,оектная,Для определения зависимости активности холестеролэстеразы в культуральной жидкости от концентраций соевой муки и кукурузного масла эа ос 5нову берут среду следующего состава,гГл: соевая мука 20, глюкоза 3,0;НаБО 2,0, К ЯРО 1,0 НС 1 0,5; МАЗОф 7 Н О 0,5; рй 7,6,Данные установленной активности 1 ОХЭ приведены в таблице 3.Т а б л и ц а 3 Из таблицы видно, что оптимальными концентрациями соевой муки икукурузного масла в среде культиврования Рэецйошопаа шепйосьпа ЦМПМВявляются соевая мука 20-40кукурузное масло 2-8 г/л. 4Преимуществом предложенного способа является повышение активности получаемой холестеролэстеразы в куль. туральной жидкости в 12 раз и сокра-,щение времени культивирования продуцента Рэецйошопаэ шеп 4 оспа ЦИПМВв 2 раза по сравнению с известным способом. Формула изобретения Способ получения холестеролэстеразы, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма Рзецйошопаз шепйос.па ЦМПМ Вна питательной среде при рН 7-7,6, содержащей глюкозу, двузамещенный фосфат калия, источник азота, ицдуктор и воду, до максимального накоп" ления фермента с последуницим осаждением фермента иэ культуральной жидф кости, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта и сокращения време ни процесса, в питательную среду дополнительно вносят семиводный сульфат магния и хлористый калий, а в качестве источника азота используют нитрат натрия, в качестве индуктора " соевую муку и кукурузное масло при следующем соотношении компонентов в питательной среде, г/л:Глюкоза 0,5-3,0Нитрат натрия 1,0-3,0Двузамещенныйфосфат калия 0,5-2,5Семиводныйсульфатмагния 0,5-0,8Хлористыйкалий 0,3-0,8Соевая .мука 20-40Кукурузноемасло 2-8Вода Остальное