Способ определения перекиси водорода при ферментативной реакции

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК АЗ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ПИСАН ОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕН Р 3039207.5;.10.80; 05.028 юл. Мф 34 ннхайм Гмб Батц (ПЕ) .8) ПЕ) 1 осЬеш ПЕРЕКИСИ ВООЙ РЕАКЦИИ тся к биологи определению ерментативной ОПРЕДЕЛЕНЕРМЕНТАТИение отноточнеедорода при(54) СПОСОБДОРОДА ПРИ (57) Изобре ческой хими перекиси во(56) Апп. СЬ 1 п.р. 24-27. р кции. Цель изобретения - повышен воспроизводимости способа путемсохранения стабильности окрашенногокомплекса. Для этого к испытуемойпробе добавляют буферный раствор оксидазы, производное антипирина и фенольное соединение, фотометрическиопределяют уровень перекиси водородапротекающей ферментативной реакции.В качестве фенольного соединения, сочетающегося с 4-аминоантипирином,оптимален п-хлорфенол, фенол и другие его производные, производные анилина, нафтол и его производные, нафталинамин и его производные, аминохиколин, оксихинолины и т,п. Взаимодействие проводят в буферном растворе срН 6-9, 1 табл.1 1338Изобретение относится к биологической химии, в частности к определению перекиси водорода при ферментативной реакции.Целью изобретения является повышение воспроизводимости способа засчет сохранения стабильности окрашенного комплекса.Способ осуществляют следующим обгразом.К испытуемой пробе добавляют буферный раствор оксидаэы, производноеантипирина и фенольное соединение. Спомощью фотометрии полученного окрашенного комплекса определяют уровеньперекиси водорода, образующейся впроцессе ферментативной реакции. Сог.ласно изобретению можно испольэоватьобычные фенольные соединения, которые могут сочетаться с 4-аминоантипирином с образованием красителя.Предпочтительным в качестве фенольного соединения является п-хлорфенол.Примерами других подходящих соединений является фенол, другие производные фенола, производные анилина, нафтол, производные нафтола, нафталинамин, производные нафталинамина, ами-нохинолины, оксихинолины, диоксифенилуксусная кислота и т.п. Взаимодействие проводят в буферном растворе. В качестве буферного вещества изначения рН пригодны условия, известные в химии пероксидазы. Предпочтительны значения рН среды в интервале 6 - 9. В остальном выбор буфера изначение рН в случае реакции, включающей энзиматическое образованиеН О , обуславливается прежде всеготребованиями, предъявляемыми к буферу и значению рН энэима, участвующего в реакции,П р и м е р 1. Определение образования Р О при окисления глицеринас помощью глицериноксидаэы.. Приготавливают реагент 1:0,1 моль/лбуфера триэтаноламина (НС 1, рН 8,0,3,6 ммоль/л или 2 г/л иэотридецилового эфира, 4,7 ммоль/л или 2 г/л натрийхолата, 10 ммоль/л п-хлорфенола,0,5 ммоль/л аминозамещенного 4-аминоантипирина, 10 Е/мл пероксидазы); реагент 2:500 Е/мл глицериноксидаэыДля проведения определения 2 млреагента 1 и 0,2 мл реагента 2 добавляют пипеткой в кювету. Экстинкцию Еотсчитывают на потенциометре при546 нм. Непосредственно после этого787 40 натная2,0 мл реагента 1 вносят в кюветупипеткой, добавляют 10 мкл реагента 2 (пробу ) и смешивают. Экстинкцию проводят через 70 мин. Далее опреде 45 ляют контрольное значение. При этомвместо раствора НО к реагенту 1 добавляют буферРезультаты исследований приведеныв таблице. 50 55) 10 15 20 25 30 35 реакцию начинают добавлением 20 мл пробы, Через 20 мин отсчитывают экстинкцию Е,. Температура инкубации составляет 25 С. Оценку проводят через калибровочную прямую, при которой иэ. меренная разница экстинкций з ЕЕ,- Е, стандартного раствора глицерина к концентрации глицерина находится в соотношении. Концентрации испытуемой смеси составляют 0,09 моль/л буфера триэтаноламина НО; рН 8,0, 1,8 г/л (3,2 ммоль/л) изотридецилового эфира, 4,3 ммоль/л натрийхолата, 9 ммоль/л п-хлорфенола, 0,45 ммоль/л аминозамещенного 4-аминоантипирина, 4 Е/мл пероксидазы, 45 Е/мл глицериноксидазы.П р и м е р 2. Исследована стабильность окраски пяти соединений. В качестве соединений для сравнения взяты 4-аминоантипирин и сульфированный 4-аминоантипирин. С этими сравнительными соединениями и новыми соединениями при использовании и-хлорфенола, 2,4-дихлорфенола и этилокситолуидина (сульфированного) в качестве фенольного компонента сочетания определяли экстинкцию Г, стабильность получающегося красителя иПри проведении испытания испольэовали следующие реагенты: реагент 1: 0,1 моль/л фосфата калия в качестве буфера, рН 8,0, 0,1 ммоль/л производного 4-аминоантипирина, 1,0 ммоль/л фенольного компонента, 2 Е/мл ПОД; реагент 2: 0,01 моль/л раствора НОУсловия определения: измерительное излучение 546 нм, толщина слоя кюветы 1 см, температура инкубации комПроцентные данные стабильности красителя (60 мин при комнатной температуре) относятся к отклонению, касающемуся измерительного сигнала, который возникает при появлении НО Иэ таблицы видно, что на 3, новые соединения изобретения оказывают лишь незначительное влияние, также и на значение экстинкции. Соединения согласно предлагаемому способу пре31338/87восходят сравнительные соединения по целью повышения воспроизводимости стабильности окрашенного комплекса. способа за счет сохрацения стабильности окрашенного комплекса, в каформулал а и э о б р е т е н и ячестве производного антипирина ис 5Способ определения перекиси водо- пользуют вещество, выбранное иэ груп- рода при ферментативной реакции, пы: 4-аминоантипирин, 1 в (С-этиламивключающий взаимодействие пробы с бу- нофенол-аминопиразолон-(5), 1- ферным раствором оксидазы, добавле- (амино-п-амино-толил)-2,3-диметил- ние производного антипирина и феноль) аминопиразолон-(5), 1-(и-диэтил-аминого соединения с последующим фото- нофенил)-2,3-диметил-аминопиразометрированием окрашенного комплекса, лон-(5), в количестве 0,1-0,5 ммоль/л о т л и ч а ю ш и Й с я тем, что, с реакционной смеси.1 Т(омпонент 4-амнно" 4-амнно-амнноан" 1-(о-этнл)"амннофеннл2,3-днметип 4"амннопнраэолон"(5)0,2 ммоль/л- (амннои-толнл)- 2,3-днметнл 4-амнно" 1 а/и-ацета- мннофеннл 2,3-днметнл"амннопнраэолон-(5) 0,3 ммоль/л 1-(и-днэтнл амннофеннл) 2, Э-днметнп-амннопн" раэолон-(5 ) 0,5 ммоль/л нтипнреакцнн антнпн- тнпнрннрнн амнн(сульфн,1 ммоль/л , рованньв)пираэолон-(5)0,4 ммоль/л Хло рфе нол,мкмоль/мл 12+53 12 Ф 42 14+ 3 9102 19+ 12 20102 19+ 03 Стабильность красителя,маКс 505 500 502 503 502 503 Днхлорфемкмоль/мл 1 О+2 Я В+73 27+1 15+21 25-12 22+03 41+12 Стабнльность краснтелямакс 507 505 50 В 507 50 В 502 фенокситолундин (сульфнрованней),мкмоль/мл 33+1 Ы 32-1 12 25-73 37-4 Х Стабнльностькрасителп,акс 550 550 546 54 В 546 546 550 Корректор В.Бутяга Техред И.Попович Редактор Е. Копча Заказ 4151/59 Тираж 776 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб.; д. 4/5