Способ тестирования химических соединений на кардиотропную активность

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 4 С О 1 И 33/48 РЕТЕНИВУ ИЕ ИЗ ИЯ ХИМИ-. ОТРОПНУЮфрагмента его растии амплиой стимуи после 4 ь ОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙОПИСАН О К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕПЬСТ(71) Научно-исследовательский институт по биологическим испытани-ям химических соединений(56) Штрасгейм Е.И., Дмитриева Н.В. Сравнительная селективность миокардиальной ткани к разным общим анестатикам. В. сб. Теоретические и методические проблемы молекулярной кардиологии. - Тезисы доклМ.: 1978, с. 65.(54) (57) СПОСОБ ТЕСТИРОВА ЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИИ НА КАРДИ АКТИВНОСТЬ путем выделени сердечной мышцы, перфузии вором Рингера и регистрац туды вызванных электричес ляцией сокращений мышцы д введения исследуемого соединения споследующим определением кардиотропной активности по изменениям измеряемых показателей, о т л и ч а ющ и й .с я тем, что, с целью повышения точности за счет дополнительного определения авторитмической ак"тивности и нервной регуляции сердца,в качестве фрагмента сердечной мышцы используют предсердие с венознымсинусом и параснмпатическими нервными стволами, регистрируют частоту иамплитуду авторитмических сокращений, затем проводят электрическуюстимуляцию сериями импульсов от 5до 50 В серии одного из нервных стволов до достижения стабильной парасимпатической остановки, измеряютее длительность, полностью восстанавливают исходную частоту и амплитуду авторитмических сокращений ичерез 3-20 мин снимают те же характеристики.0 15 20 25 30Ф35 40 4 50 55 Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биофизике и может быть использовано для скрининга биологически активных веществ на кардиотропную активность.Цель изобретения - повышение точности тестирования эа счет дополнительного определения авторитмической активности и нервной регуляции сердца. Способ осуществляют следующим образом.Тестирование проводится на развер. нутых препаратах предсердий сердец осецне-зимних лягушек Яапа Сешрогагха с сохраненным сцнусовым узлом, парасцмпатическими нервами, Для этого лягушек обездвцживают разрушением сшцшого и головного мозга ц закрепляют на парафцновой основе брюшной стороной вверх, вскрывают грудо-брюшную полость, обнаруживают веточки парасимпатическцх нервов и освобождают их от окружающих тканей. 11 золцруют сердце и помещают его в чашку Петри, где отсекают .,желудочек ц приготавливают пред- сердце и синусовый узел к работе. Приготовленный препарат фрагмента сердца с парасимпатическим стволом помещают в проточно перфузируемый биоблок, Препарат закрепляется ца крепежные крючки с помощью микровцнта, растягивается примерно на 1/3 первоначальной длины. Парасимпатический ствол помещают на хлор- серебряные электроды и раздражают сериями импульсов длительностью 0,5 мс, силой 10 В и с частотой 10 Гц различной продолжительности от 5 до 50 стимулов в пачке. Фрагмент миокарда врабатывают в течение 60 мин до установления стабильного уровня авторитмической активности, амплитуды сокращений ц длительности парасимпатической остановки. После этого записывают эти показатели ц через 3-20 мцн после стимулирования нерва проверяют еще раз стабильность остановки, после чего в перфузионный раствор добавляют испытуемое вещество и снимают те же характеристики, причем длительность парасимпатцческой остановки определяют по формуле Л =- 1 100 (1) ф Пр где Пн - длительность парасимпатической остановки в норме, П-вдлительность парасимпатической остановки при действии тестируемогохимического соединения, и - количество стимулов в пачке.Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и и е р 1. Оценка действия известных кардиотропных средств.Выделяют предсердие с сохраненным синусовым узлом и парасимпатическими нервами и помещают в перфузируемую раствором Рингера биоблок, Раздражают парасимпатический невный ствол фрагмента миокарда лягушки сериями импульсов от 5 до 50 стимулов в пач. ке и добиваются стабильной по длительности остановки, До 5 стимулов парасцмпатической остановки не наблюдается, а свыше 50 сердце лягушки полностью останавливается,Раздражают парасцмпатический нервный ствол препарата 5 стимулами в пачке и добиваются стабильной по длительности остановки.Регистрируют амплитуду сокращений, частоту авторитмцческой активности и длительность остановки авторитмической активности предсердия. Вводят известное вещество блокатор холинорецепторов-атропин в концентрации 10 И, Через 3 мин измеряют те же параметры. Прц действии вещества изменилась частота и длительность парасцмпатической остановки, амплитуда сокращений не изменилась.Частота спонтанных сокращений при действии атропина возрастает на 207, в то время как продолжительность парасимпатической остановкиуменьшается с 6 с до нуля, амплитуда сокращений не изменяется и равняется 320 мг. Лналогично производят оценку действия известного вещества, ганглиоблокатора, бензогексония. Для получения стабильной остановки серд" ца применяют стимуляцию парасимпатического нерва 50 стимулов в пач" ке. Б норме остановка в течение 3-20 мин . Однако стабильное уменьшепце парасимпатической остановки прц раздражении нерва наблюдается только после 20 мин воздействия этого вещества на препарат предсердия, Дальнейшая выдержка вещества не влияет на длительность парасимпати -1244593 ВНИИПИ Заказ 3910/48 Тираж 778 Подписное Произв,-полигр, пр - тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ческой остановки. Вензогексоний вконцентрации 10М влияет на длительность парасимпатической остановки, не оказывая какого-либо влияния на амплитуду сокращения, частотуавторитмичсской активности, Для количественного сравнения действияразличных химических соединений надлительность парасимпатической остановки следует пользоваться формулой (1). Расчет показывает, что длительность парасимпатическои остановки снижается с 8,2 до 5,2 с. Лмплитуда сокращений и частота авторитмической активности не изменяется исоставляет соответственно 290 мг и0,4 Гц,П р и м е р 2. Оценка кардиотропного действия продигцозанз.Выделение и измерение параметровтест-объекта проводятся так же, каки в примере 1,Тестируемое вещество, продигиозан обладает рядом неспецифическихтерапевтических эффектов,связанныхвпервую очередьс ихдейстнием нацентральные механизмы терморегуляции ииммунологической реактивности организма, на метаболизм медиаторов ипроницаемость клеточных мембран.Для данного тест-объекта выбранаоптимальная по длительности остановка, вызванная стимуляцией парасимпатического ствола 30 стимуламнв пачке. Испытуемое вещество вводят в концентрации 10 пмл и измеряют частоту, амплитуду сокращенийи длительность параспмпатическойостановки через 10 и 20 мин, Продигиозан вызываетчерез 10 мин небольшое увеличение амплитуды сокра"щений, а в течение последующих20 мин. Продигиозан вызывает через10 мин небольшое увеличение амплитуды сокращений, а в течение последующих 20 мин амплитуда сокращенийуменьшается до исходных значений.Стимуляция вагосимпатическогонервного стволавызывает кратковременную остановку сократительной.активности. В среднем в 25 экспериментах длительность остановки составляла 7,4 с. В большинстве экспериментов стимуляция нерва через20 мин перфузии продигиозаном при 5. прочих равных условиях вызывалаувеличение продолжительности паузыв среднем на 56,7 Й 0,07 (и = 12).Эффект продигиозана на нервнуюрегуляцию сердца не появляется ра О нее, чем через 10 мин после началадействия вещества, Максимально выраженный и постоянный эффект продигиозана наблюдается спустя 20 мин,в течение которых раздражение нерва 15 не производят. Повторную,длительную остановку сократительной активности можно получить при стимуляции нервов с периодом 10-20 мин.Приповторной стимуляции через 3 мин па расимпатическое торможение незначительно - соответствует парасимпатической остановке в отсутствие препарата (7 с). 25 Для уточнения действия веществавводили микроэлектрод в клетку фрагмента миокарда. Наблюдали изменениедлительности потенциала действияпри действии продигиозана, во время З 0 максимума положительного инотропногоэффекта потенциал действия укорачивался на 13,57 (и = 7). Этот фактсогласуется с предположением о том,что продигиозан усиливает выброс 35ацетилхолина из пресинаптическихтерминалей. Из полученных данных можно сделать вывод, что липополисахарид бактериального происхождения продигио зан обладает кардиотропной активностью: усиливает парасимпатическоеторможение, увеличивает амплитудусокращения и не влияет на частотусердечных сокращений. Наиболее ве роятным механизмом действия липополисахарида, является увеличение высвобождения медиатора .(ацетилхолина)из пресинаптпческих нервных окончаний для стимуляции парасимпатичес кого ствола.