Способ получения полиауксотрофных мутанов

союз советскихсоциАлистичеснихРЕСПУБЛИК 4 С 12 МИТЕТ СССРй и ОтнРцтий ГОСУДАРСТВЕННЫИ Н ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕН ОПИСА К детОЕСИ ИЕ ИЗОБРЕТЕНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ударст- .ский др. Генетичесцируемые транс 7 Ьгю е 1 гог П,построения герного вибрио 1980, У 11,Зфф(56) Смирнова Н.И, икие перестройки, индупозонами в хромосомеих использование длянетической карты холена. - "Генетика", 16,1187-1194,Я 01171522; (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИАУКСОТРОФНЫХ МУТАНОВ Уегздп 1 а рез 1 з пу-.тем транслокации транспозона и акализа популяции на присутствие мутаций,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью получения полиауксотрофовс заданными мутациями, трансдуцируютфагом Р 1 сш 1 с 1 г 100 гз в реципиентную клетку стабильные мутации, каждуюиз которых индуцируют различнымитранспозонами с предварительной селекцией на полноценной питательнойсреде.Изобретение относится к бактериальной генетике, а именно к получению штаммов с множественной ауксотрофностью.Известен способ получения полиауксотрофных штаммов ЧЬго спо 1 егае с помощью перестроек, индуцированных транспозонами (Тп), предусматривающий введение Тп 10 или Тп 9 в геном исследуемого микроорганизма и поиск среди клонов, получивших транспозон моноауксотрофных мутантов, в популяции которых с помощью прямого анализа или метода пенициллинового обогащения выявляют индуцированные транспозоном дополнительные разнообразные мутации.Однако этот способ позволяет получать случайный набор ауксотрофных мутаций, а не заранее определенный задачами предстоящего эксперимента, Дополнительные мутации возникают в результате инверсий, когда участки хромосомы оказываются перевернутыми на 180, или делеций (утраты фрагментов ДНК различной длины), что существенно меняет порядок генов и ее структуру. Поэтому такие полиауксотрофные штаммы являются нетипичными и не могут быть использованы в большинстве генетических экспериментов. Более того, ауксотрофы, появляющиеся в результате инверсий, нестабильны и с высокой частотой реверсируют к исходному типу, Данный способ является трудоемким особенно применительно к чумному микробу, поскольку требует проверки большого количества клонов, использования многократного пенициллинового обогащения и занимает много времени.Цель изобретения - получение полиауксотрофов чумного микроба с заданными мутациями. Это достигается тем, что согласно способу получения полиауксотрофных мутанов Уегвппа ревг.в путем транслокации транспозона и анализа популяции на присутствие мутаций трансдуцируют фагом Р 1 сш 1 с 1 г 100 гв в реципиентную клетку стабильные мутации, каждую из которых индуцируют различными транспозонами с предварительной селекцией на полноценной питательной среде.П р и м е р 1Культуру 7. ревйв с встроенным в определенном локусе хромосомы трапспозоном, напри 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 мер, У, реяг 1.в ЕЧ аг 8 Тп 10 выращивают в бульоне ЬВ до концентрации 1 10 клеток в 1 мл. ПослеЯэтого добавляют лизат фага Р 1 сш 1 с 1 г 100 гв, индуцированного из штамма с известной нужной ауксотрофностью, опосредованной другим транспозоном, например яцаТп 5. Множественность инфекции должна быть равной 1. Через 1 ч инкубации при 28 С смесь культуры и фага высевают на 1,5 Е агар ЬВ, рН 7,2, содержащий в данном случае 100 мкг/мл канамицина. Через 3 сут инкубации посевов при 28 С появляется рост в виде изолированных колоний, Бактерии из нескольких колоний проверяют на получение дополнительной ауксотрофности, в приведенном примере по гуанину, с использованием синтетической среды,Частота котрансдукции ауксотрофности с Тп 5, Тп 7, Тп 9, Тп 10составляет 70-1002. Полученный предлагаемым способом диауксотроф У. ревгхв ЕЧ агяТп 10 яца : Тп 5 подвергают аналогичной обработке лизатом Р 1 сш 1 с 1 г 100 гв, индуцированным из штамма с требуемой ауксотрофностью по триптофану, котораяобусловлена Тп 7 (гр:;Тп 7). Такимобразом получают штамм, зависимыйот трех нужных аминокислот У. ревГв ЕЧ агя ;: Тп 10 8 цаТп 5игрТп 7.П р и м е р 2, Ночную бульонную культуру У, реяв ЕЧ .1 чТп 3обрабатывают по описанной методикелизатом Р 1 ст 1 с 1 г 100 гв,индуцированным из У, ревгхв ЕЧ вег :; Тп 5,с высевом смеси на агар ЬВ с канамицином. После проверки выросшихканамицинрезистентных клонов наауксотрофность по серину, получившийся диауксотроф У. ревгя ЕЧ1 чТп 3 вегТп 5 обрабатывают фагом Р 1 сш 1 с 1 г 100 Гв, индуцированным из 7. ревгдв ЕЧ цга:Тп 10, с высевом смеси на агарЬВ с тетрациклином. 70-1007 тетрациклинрезистентных клонов, выросшихв этих условиях, будут иметь генотипУ. ревСв ЕЧ 1 чТп 3 вегТп .5цгаТп 10,П р и м е р 3, Если для последующих экспериментов по картированиюхромосомы У. ревгдв требуется штамм1171522 10 ТехредО.Гортвай Корректор В. Синицкая Редактор Л. Письман Заказ 2998/3 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5.Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная,4,реципиент, ауксотрофный по пролину,аланину, тиамину, аденину, ночнуюбульонную культуру У. ревСдв ЕЧргоТп 9 обрабатывают Р 1 сш 1 с 1 г100 в индуцированным из У. реведвЕЧ а 1 аТп 1. После проуерки выросших ампициллинрезистентных клоновна ауксотрофность по аланину, полученный штамм обрабатывают лиэатомфага Р 1 сш 1 с 1 г 100 св индуцированным из У. ревй 1 в ЕЧ ТМ ;.: Тп 5 свысевом на агар с канамицином, а вотобранные штаммы 7. ревалда ЕЧргоТп 9 а 1 аТп 1 гпту. ;: Тп 5вводят ауксотрофность по аденину путем трансдукции этого маркера из У. ревС 1 в КЧ ас 1 еТп 10.Таким образом получают штамм с заданными маркерами У. рев 1 в ЕЧ ргоТп 9 а 1 аТп 1 М : Тп 5 ас 1 еТп 1 О,Предлагаемый способ позволяет комбинировать в изучаемых штаммах У. ревС 1 в различные заведомо заданные ауксотрофности, дает воэможность использовать для селекции полноценные питательные среды, что особенно упрощает работу с чумным микробом, отличающимся прихотливым ростом на синтетических средахПолученные полиауксотрофы стабильны и для получения нескольких нужных новых вариантов требуется не больше месяца.1