Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны

СВОЗ СОВГТСКИХсОциАлистическихРЕСПУБЛИК 2 й 15/О ТЕНТНОЕ ОСУДАРСТВЕННОЕ ВЕДОМСТВО СССР ГОСПАТЕНТ СССР) ФЮИИЛИ ЧУДИ Е ИЗОБР А исследователь венной микро овлова, В.И.Са селекции клубен ческие рекоменд обиологии, 1984,У 00 К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Всесоюзный научноинститут сельскохозяйслогии(56) Генетические методыковых бактерий (методиции). Л., ВНИИ с/х микр30-35,) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММ НЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ЛЮЦЕРНЬ Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению штаммов клубеньковых бактерий с улучшенными свойствами.Цель изобретения - предложить генетический способ получения штаммов клубеньковых бактерий люцерны, сохранивших высокую аэотфиксирующую активность и симбиотическую эффективность исходных штаммов и повысивщих их эа счет увеличения количества клубеньков, образуемых полученными штаммами, повысивщих свою конкурентоспособность, что закреплено наследственно, В качестве такого способа предлагается проводить триродительское скрещивание щтаммов клубеньковых бактерий люцерны. АцгоЬастегцп гЫгоцелез Д 32 15834, содержащего плазмиду рРОЙ, и бактерий ЕзсЬегспа со с 600, несущего плазмиду ВР 4-4, и отбирать клоны, Плазмида рРОМ получена на основе собственной корне индуцирующей плазмиды штамма 1822883 А 1(57) Использование; в области сельскохозяйственной микробиологии, для получения штаммов клубеньковых бактерий люцерны с повышенной конкурентоспособностью. Сущность изобретения состоит во введении в геном бактерий дополнительной плаэмиды рРО 4, промаркированной транспоэоном Тп 5-щоЬ, с помощью триродительского скрещивания штамма клубеньковых бактерий люцерны штамма АцгоЬастегопт гЫго 9 епез Д 32 15834, и штамма бактерий ЕзсЬегСЫа со С 600, несущего плазмиду ВР 4-4, и последующего отбора клонов с высокой аэотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью. 3 табл.1 ил,АцгоЬастегцгп гЫго 9 епез 15834 путем маркирования ее транспоэоном Тп 5-гпоЬ. Донором плазмиды рРОч служит штамм АцгоЬастегца гЫоцепез Д 32 (штамм 15384, промаркированный указанным транспозоном), устойчивый к рифампицину и канамицину в концентрации, соответственно, 40 и 200 мкг/мл. Плаэмида рРОМ имеет молекулярную массу в 258 М и представляет собой коинтеграт двух плазмид меньшей массы (107 и 154 М). поэтому в клетках ВтгоЬопт глеот она может быть представлена в виде трех плазмид с молекулярной массой 107, 154 и 258 М. Эта плазмида несет гены, контролирующие индукцию "бородатых" корней у щтаммов А 9 гоЬастегит гЫгоцепез (М/тте Е.Е., чезтег Е.Ю Нагу гоот; разгпО епсобез чгоепсе тгатз п АягоЬастегогп гЬоцепез - Вастс о., 1980, 141.3, 1134 - 1141). Донором плаэмиды ВР 4-4, несущей гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину (концен 1822883трация антибиотиков в среде, соответственно. 20 и 100 мкг/мл), служит штамм ЕзсЬегсЬа со 1 С 600 (51 птоп й. Н 19 Ь тгесоепсу птоЬ 1 геоп от ягат-пе 9 атче Ьастега гер 1 сопз Ьу Йе 1 п чтго сопзсгцссеб Тп 5-птоЬ тгапзрозоп. - "Моес. Ьеп. Ьепет"- 1984, 196.3, 413-420.Сущность изобретения поясняется следующими примерами его реализации,П р и м е р 1. Трехродительские скрещивания проводят на питательной среде следующего состава: КгНРОа - 0,5 г; М 9 Юа х х 7 НгО - 0,2 г; чаС -0,1 г; СаСОз - следы; маннит - 10,0 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; вода дистиллированная - 1 л, рН 7,0 - 7,2. Выращивание при 28 С в течение 24 ч. Густые суспензии родительских штаммов наносят каплями на агаризованную среду указанного состава (20,0 г агара на 1 л среды), Через 16-18 ч клетки собирают в пробирки с 1 мл стерильной воды и высевают на чашки Петри с указанной агаризованной средой с добавлением антибиотиков - канамицина и стрептомицина (1000 мкг/мл) или канамицина и ноеобиоцина (120 мкг/мл). Одновременно на эти среды высевают контрольные варианты, из которых делают разведения с высевом на указанную питательную среду для определения частоты появления рекомбинантов, Реципиентный штамм клубеньковых бактерий люцерны должен быть маркирован устойчивостью к стрептомицину или новобиоцину. Клоны рекомбинантов появляются на 4 сутки при выращивании при 28 С, В наших опытах было выявлено 3 независимых скрещивания, частоты появления канамицин-устойчивых клонов у штамма СХМ 1-105 КЫгоЫвт пте 1 ос 1 составляли 10 - 10 . Из каждого скрещивания отбирали по 3 рекомбинанта и проверяли их симбиотические свойства в условиях стерильного микровегетационного опыта на растениях люцерны сорта Зайкевича. В большие пробирки объемом 60 мл вносили по 5 г вермикулита, промытого и прокаленного при 800 С в течение 2 ч. В каждую пробирку добавляли по 10 мл среды Красильникова-Кореняко следующего состава: КгНРОа - 1 г; М 930 а - 1 г; СазРОа)г - 0,2 г; ГеЯОа - следы; вода дистиллированная - 1 л. Пробирки со средой стерилизовали в автоклаве, Семена люцерны стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 5 минут, промывали стерильной водой и проращивали до появления корешка размером 3-6 мм (1-2 суток) при 28 С. Проростки раскладывали по 2 в каждую пробирку. Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивали на агаризоеанной среде указанного выше со. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 става (без антибиотиков) при 28 С в течение 2 суток и суспендировали е растворе микроэлементов: НЭВОз - 0,05 г; (МНа)гМоОа - 0,05 г; КС - 0,005 г; йаВг - 0,005 г; ЕпЯОа х х 7 НгО - 0,03 г; Аг(ЯОа)з х 18 НгО - 0,003 г; МпЗОа - 0,002 г; вода дистиллированная - 1 л. Через сутки после посева семян в кажду 7 ю пробирку вносили по 1 мл инокулюма (10 10 е) кл/мл. Опыты ставились в 12-кратной повторности. Растения выращивали в теплице при 25 С в течение 30 дн. По истечении 30 дней пробирки герметично закрывали и вводили в них шприцем ацетилен до концентрации 10 по обьему. Количество этилена, образовавшегося в результате восстановления ацетилена нитрогеназой клубеньковых бактерий, определяли через 24 часа на газовом хроматографе. Величину ацетиленредуктазной активности клубеньков, являющуюся показателем интенсивности работы нитрогеназы, определяли по формуле М(СгНг) =Пр, Чст. х Ч 10-6 Мх1 ст. Нпр. х 22.4где М(СгНг - ацетиленредуктазная активность клубеньков (ммоль/сос 24 ч);1,р - длина пика этилена, полученного при введении исследуемой пробы;1 ст. - длина пика, полученного при введении стандартной пробы 0,1 этилена;Чст, - обьем стандартной пробы;Чпр, - обьем исследуемой пробы;Ч - обьем пробирки с растениями.Способность к индуцированию "бородатых" корней исследовали на раневых поверхностях листьев табака в асептической культуре по методике, описанной в работе Вегсеюте 1. Стг 19 п 1 О., Абатп Я., Оач 1 б С Могрйо 9 епе 1 с апб се 11 цаг геог ептабопз 1 пбосеб Ьу А 9 гоЬастег 1 игп гтго 9 епез (зга 1 пз 1855, 2659 апб 8196) оп саггос, реа апб соЬассо - "Рапт Зс", 1987, 52, 3, 195-210,Семена табака стерилизовали раствором 30 перекиси водорода и 96 этиловым спиртом, взятым в соотношении 1;1, в течение 10 минут. Затем их помещали на среду Мурасиге и Скуга без гормонов (мг/л) : ЙНайОз -1650; КЙОз -1900; СаСг х 2 НгО - 440; М 95 0 х 7 Нг О - 370; К Нг Р Оа - 170; НЗВОз - 6.2; МпЯОа х 4 НгО - 22,3; СоС 1 г х х 6 НгО - 0.025; СОЯОа х 5 НгО - 0,025; ЕпЯОа х 7 НгО - 8,6; йагМоОа х 2 НгО - 0,25; К,1 0,83; РеЯОа х 7 НгО - 27,8; Маг ЭДТА х 2 НгО - 37,3; тиамин-Н С - 0,1; пиридоксин - НО - 0,5; никотиновая кислота - 0,5; мезо-инозит - 100; глицин - 2,0: индоксилуксусная кислота - 2,0; кинетин - 0,2: сахароза - 30000. рН 5,6 - 5,8. Выращивали е течение 2-3 недель. Срезанные листья проростковнадсекали перпендикулярно главной жилке и помещали в суспенэию клубеньковых бактерий, выращенных в течение суток на качалке в жидкой среде с маннитом и дрожжевым экстрактом приведенного в примере 1 состава. В бактериальной культуре листья табака выдерживали 1-2 часа и переносили на среду Торри без гормонов (мг/л); МЯЮ 4 х 7 Н 20 - 42; Са(ВОЗ)2 х 4 Н 20 - 242; КМОз; КС - 61: КНгРО 4-20; ГеСз- 1,5; Мп 504 х Н 20 - 4,5; Еп 304 х 7 Н 20 - 1,5; НзВОз,25; йа 2 МоОа х 2 Н 20 - 0,25; СцЯ 04х 5 Н 20 - 0,04; никотиновая кислота - 5,0; тиамин-НС - 1,0; сахароза - 60000. рН 6,0, Выдерживали 12 ч и перекладывали на среду Мурасиге и Скуга укаэанного состава с добавлением 0,25 мг/л бензиламинопуринаи 0,05 мг/л а-нафтилуксусной кислоты. Учетпатогенности проводили на 14 день после инокуляции. Характерный фенотип "бородатых" корней; корни, индуцированные патогенными рекомбинантами, отличаются от нормальных корней тем, что они быстрее растут, сильнее разветвлены, имеют вертикальное и горизонтальное направление, а не только вниз. Растения, регенерированные из трансформированных корней, сильно ветвятся, имеют сморщенные листья.Результаты микровегетационного опыта и определение способности к индуцированию "бородатых" корней представлены в табл.1.Как видно из табл,1, ацетиленредуктазная активность не отличалась достоверно от контрольного варианта (эа исключением штамма под М 9), что указывает на сохранение азотфиксирующей активности штаммареципиента. (Масса растений также не различалась, поэтому данные о ней не приводятся), Восемь из полученных штаммов обладали усиленной вирулентностью и образовывали большее количество клубеньков на растениях люцерны, чем штамм-реципиент. Все полученные штаммы, в отличие от штамма-донора, не обладали несвойственной и ненужной для ВЫгоЫоп способностью индуцировать "бородатые" корни,П р и м е р 2. В микровегетационном опыте по той же методике была исследована динамика нодуляции корней люцерны после инокуляции 4 иэ полученных рекомбинантов. Каждым рекомбинантом, а также - в качестве контроля - штаммом-реципиентом инокулировали по 30 проростков. Отмечалось среднее количество клубеньков на 1 растение на 9-й, 10-й, 15-й, 22-й и 30-й дни.Результаты представлены на фиг,1.Как показано на чертеже, отобранные штаммы превосходят исходный родитель 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ский штамм по скорости образования клубеньков на люцерне,Известно, чтоу мутантов КЬгоЫоа тео 0 с задержкой нодуляции отмечается снижение конкурентоспособности, соответственно ускоренная нодуляция будет коррелировать с усиленной конкурентоспособностью. Для анализа конкурентоспособности исследуемых штаммов был поставлен микровегетационный опыт, в котором использовали метод относительной оценки конкурентоспособности по массе растений по методике. изложенной в статье Л.А.Шарыповой и Б,В,Симарова "Метод сравнения конкурентоспособности эффективных штаммов ВЫгоЫцгп веот - Труды ВНИИ с/х микробиологии, т,55, 1985, с, 85 - 90. Совместно с исследуемым штаммом была проведена инокуляция неактивным штаммом СХМ, обладающим высокой конкурентоспособностью, в концентрации, в 1000 раз превышающей концентрацию исследуемых рекомбинантов. Конкурентоспособность учитывали как отношение прибавки массы растений, полученной при совместной инокуляции, к прибавке массы растений, полученной в варианте моноинокуляции активным штаммом. Использование больших пробирок позволило выращивать растения в течение 2 мес, Результаты опыта приведены в табл.2.Как показывает табл.2, по своей симбиотической эффективности исследуемые штаммы на 20-40 превзошли исходный штамм СХМ 1-105. Конкурентность рекомбинантов в 2-3 раза превосходила конкурентоспособность штамма СХМ. Для окончательной оценки конкурентоспособности полученных рекомбинантов был поставлен вегетационный опыт на нестерильном песке в 3-килограммовых сосудах в пятикратной повторности. В качестве инфекционной нагрузки был также использован штамм СХМ 1-48 а соотношении 1000;1, Результаты опыта приведены в табл,З.Как показывает табл,З, отобранные рекомбинанты обладают не только высокой симбиотической эффективностью и азот- фиксирующей активностью, но также способны успешно конкурировать с местной популяцией клубеньковых бактерий за сайты взаимодействия на корнях люцерны. Кроме того, в той же таблице 3 показаны результаты анализа абсолютной конкурентоспособности этих штаммов по маркеру устойчивости к канамицину. Для этого из клубеньков, образованных на корнях люцерны, выделяли штаммы бактерий и высевали их на селективную среду с канамицином. Было проверено по 100 клу1822883 20 Таблица 1 Свойства рекомбинантов СХМ 1-105 (рРОИ) беньков. Результаты показывают, что метка сохраняется, и отобранные штаммы действительно высококонкурентоспособны, Стабильность сохранения плазмид в клетках В.веПоО проверяли в течение 1,5 лет методом электрофореза в агаровом геле. Отобранные рекомбинанты были стабильны. Таким образом, можно заключить, что предлагаемым нами способом можно на основе селекционных штаммов быстро получать штаммы с высокой азотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью эа счет повышения их конкурентоспособности, повышения количества клубеньков, образованных этими штаммами,Формула изобретения Способ получения штамма клубеньковыхбактерий люцерны, включающий введение в их геном дополнительных плазмид, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышенияазотфиксирующей активности и симбиотической эффективности штаммов за счет повышения количества образованных клубеньков, введение в геном дополнительных плазмид 10 проводят путем триродительского скрещивания штамма клубеньковых бактерий люцерны, штамма бактерий АдгоЬас(егов гЬгооепез Д 32 15834, содержащего плазмиду рРОЙ, штамма бактерий ЕзспегсЬа соИ 15 С 600, несущего плазмиду ВР 4-4, и отбираютклоны, обладающие повышенной азотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью.1822883 10Таблица 2 Симбиотические свойства рекомбинантов в условиях микровегетационного опытаа 2биотические свойства рекомбинантов в условиях вегетационного опыта1822883 Л с. Г 1 гкм - г-9 10 2 5 оставитель Н.Новиковаехред М.Моргентал Корректор М,Кул эктор Т.Шагов каз 2 174 Тираж ВНИИПИ Государственногп комитета по изобр 113035, Москва. Ж, Рвуш Производств но и.щательсии комбинатлЛ О л Подписноеетениям и открытиям при ГКНТ СССРская нвб 4/5