Способ определения динамики таксиса анизотропных по форме микроорганизмов

,С 1 00 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННИЙ НОМИТЕТ СССР 00 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ(72) В.Н. Врезгуйов и Л,10. Завальский (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии(54) (5.7) спосоБ опРкделкния пинАиикиТАКСИСА АНИЗОТРОПНЫХ ПОФОРИЕ ИИКРООРГАНИЗМОВ, включа 10 щий введениеградиента раздражителя в суспензиюбактерий, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, .с целью повьаиения чувствительности и ускорения способа, послевведения градиента раздразителяспектрофотометрически регистрируюториентацию клеток.Изобретение относится к микробиологии и может быть использованодля определения динамики анизотропных по форме микроорганизмов в применениях к микробиологической промьшленности, а также к медицинским исследованиям,Предлагаемый способ позволяетпроводить оперативное измерение таксиса анизотропных по форме микроорганизмов, а следовательно, определять наличие подвижности у бактериальных клеток и оценивать динамикуих поведения при воздействии градиента раздражителя, 15Известен способ определениятаксиса микроорганизмов с помощью капилляра, Сущность способа заключается в том, что капилляр с раздражителем (в частности, с хемоэффектором - аттрактантом или репеллентом)открытым концом (противоположныйконец капилляра запаян) вводится в0-образную трубку, находящуюся напредметном столике микроскопа. Через 25час капилляр извлекается из камеры,его содержимое выдувается в пробирку с питательной средой, и далеесодержимое пробирки выливается вчашку с питательной средой, послечего подсчитывается число колоний.Время измерения составляет околосуток 11 .. К недостаткам способа относитсяплохая воспроизводимость результа 35тов, обусловленная низкими точностями микробиологических операций(посевы, подсчеты колоний и т.д.) иневозможностью создания и измененияградиентов. раздражителя в соответствии с требованиями эксперимента.1 ВВоспроизводимость метода составляет+15 Х и позволяет определить наличиетаксиеа к определенным раздражителям.Этот способ не может быть применен . 45для изучения быстрой динамики процессов таксиса, так как точность визуальных наблюдений в капилляре чрезвычайно низкаполучение результатовтребует продолжительных затрат напроведение эксперимента. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ определения таксиса по слежению за образованием полосы бактериальной популяции (21Для осуществления способа разработана установка, в которой испбльзован принцип определения числа бактерий по интенсивности светорассеяния в направлении, перпендикулярном падающему лучу лазера, Указанный принцип справедлив при концентрации бактерий ниже 10 клеток/мл. Задача за 7ключается в определении изменений мигрирующей полосы бактерий после ее образования. В конкретном эксперименте по изучению таксиса Ба 1 шопе 11 а йурМшцгхцш перераспределение клеточной концентрации регистрируется через 15 мин после наслоения градиента хемоэффектора на равномерно распределенные по кювете бактерии, Однако вклад в интегральное свето- рассеяние обуславливается не только клетками, обладающими таксисом, а всеми клетками, имеющимися в суспензии. Кроме того, способ обладает низкой чувствительностью, так как регистрация эффекта изменения светорассеяния в ограниченном телесном угле при малых концентрациях клеток не позволяет получить высокого отноше. - ния сигнал/шум.Целью изобретения является повышение чувствительности и ускорение способа.Поставленная цель достигается тем, что при способе определения динамики таксиса анизотропных по форме микроорганизмов, включающем введение градиента раздражителя в суспензии бактерий, после введения градиента раздражителя спектрофотометрически регистрируют ориентацию клеток,Изменение оптической плотности обуславливается изменением светорассеяния за счет обнаруженного явления ориентации микроорганизмов при положительном или отрицательном таксисе в градиентах раздражителя.Указанный эффект, заключающийся в изменении светорассеяния из-эа ориентации клеток, наблюдается только для клеток, обладающих анизотропной формой (палочки, цилиндры, элпипсоиды вращения и т.д.). Для клеток абсолютно сферической формы этот эффект не имеет места. Следует отметить, что большинство подвижных клеток, обладающих эффектом таксиса, имеет анизотропную форму.Поскольку ориентация клеток в градиенте раздражителя осуществляется1154328 ВНИИА Заказ 3960 Тмоаж 525 Подписное Филиал ППП "патами, г, Ужгород, ул,Проектная,4 быстро (менее чем за 1 с), предложен-,ный способ позволяет определять таксис микроорганизмов прежде, чем начнут появляться концентрационные изменения, и следить за динамикой 5процесса возбуждения клеток. Приэтом указанные изменения вызванытолько клетками, обладающими собственной физиологической подвижностьюв градиенте раздражителя. 10Возможно применение различных методик регистрации, в том числе и регистрации изменений оптическойплотности вдоль падающего луча, т.е. приоуглах рассеяния близких к 0 , . 15Расчет и проведенные эксперименты показывают, что изменение оптической плотности при измерениях вдольпадающего луча светаза счет ориентации клеток в процессе таксиса составляет 5-103 от оптической плотностисуспензии. При концентрации клеток всуспензии порядка 10 клеток/мл(при такой концентрации обычно проводят эксперименты) эта величина ре- д 5гистрируется обычными фотометрическими системами с соотношением сигнал/шум не хуже 100,Измеряемыми характеристиками являются: форма кривой изменения оптической плотности суспензии микроорганизмов во время воздействия градиента раздражителя и ее зависимостьот начальной, интенсивности (концентрации); амплитудное значение эффек 35та изменения оптической плотностии характеристика этой величины приразличных интенсивностях (концентрациях) раздражителя; .форма кривойпроцесса адаптации микроорганизмов(обратное изменение оптической плотности) к градиенту. раздражителя приего различных начальных интенсивностях (концентрациях),45П р и м е р, В эксперименте определялось наличие хемотаксиса у бактерий ЕзсЬег 1 сЬда со 11 К, имеющих форму вытянутого эллипсоида вращения. Суспензия бактерий при оптичес 50 кой плотности 0,3 помещалась в оптическую кювету, в верхней части которой находилась дополнительная кювета с,мембранным фильтром. Оптическая .кювета облучалась лучом фотометрической системы (ФЭКМ), с помощью55 которой осуществлялась регистрация(с помощью ЭПП) изменений оптического сигнала, Инжекция хемоэффекторавыполнялась с помощью микропипетки.При инжекции хемоэффектора в дополнительную кювету он под действиемпроцесса диффузии проникал в пространство оптической кюветы и суспензию бактерий. За счет диффузии и седиментации создавался градиент хемоэффектора в суспензии бактерий, Записывались изменения оптического сигнала при инжекции 20 мкл 10 ,И Ь-серийа и при инжекции 20 мкл 20 Х этилового спирта. По оси ординат откладывали уменьшение оптической плотности0 суспензии бактерий Е. со 11 К,по оси абсцисс - время. С учетом времени диффузии и образования градиента хемоэффекторов время отклика оптического сигнала не превышает однойминуты.Инжекция 20 мкл буфера (того жесостава, как в кювете) не вызвалаизменений оптической плотности, также как и воздействие указанных хемоэффекторов на клетки Е, со 1, не имеющие жгутиков.Из записей можно сделать следующие выводы:1. Хемотаксис у исследуемых бактерий Е. со 11 Кесть, а следовательно, эти клетки обладают подвижностью.2. Формы кривых изменения оптической плотности во время действия градиентов различных раздражителей ив период их адаптации к этим раздражителям отличаются.3. Соотношение сигнал/шум в приведенных записях не хуже 100,Таким образом, предлагаемый способ позволит оперативно определятьтаксис бактериалъных клеток и регистрировать его динамику, а следовательно, может быть полезен для быстрогоопределения подвижности микроорганизмов, идентификации соответствующихрецепторов (например, хеморецеторов при хемотаксисе, наличие двигательного шока при фототаксисе ит,д.), исследования вопросов работырегуляторной системы бактерий и подбора раздражителей при направленномразделении клеток с использованиемявления хемотаксиса,