Способ определения количества жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в ризоторфине

СОЮЗ СОВЕТСИИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН С 12 И 1/00, С 12С 04 Р 11/08 ИЭОБРЕТЕНИ тельой ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРМТИЙ И АВТОРСКОМУ СИИ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВАЖИ 1 НЕСПОСОВНЦХ КЛЕТОК КЛУВЕЯЬКОВИХВАКТЕРИЯ В РИЭОТОРфИНЕ(57) Предлагаемый способ относитсяСедьскохоэяйственной микробиологиии йоает быть использован для оценкикачества бактериального удобрения,801419518 риэоторфина. Целью изобретения является ускорение и упрощение способа.Способ заключается в следующем. Суспензию риэоторфииа в 13-ном поливи-,ниловом спирте фильтруют, центрифу"гируют, осадок клеток ресуспендируютв буферном растворе и инкубируют с:,субстратом 4-нитрофенилЪ-глюкопиранозидом, гидролизующимся ферментом -глюкозидаэой в присутствиитолуола. в течение 2 ч при 37 С, окраюенные образцы фотометрнруют при430-440 нм на. спектрофотометре и по"лученные значения оптической плотности сравнивают со значением оптической,плотности для суспензионных культурклубеньковых бактерий с известнымтитром хизнеспособных клеток. 1 табл,1410518 10 2Изобретение относится к сельско- Для определения количества жизне- хозяйственной микробиологии и может способных клеток в бактериальном пребыть использовано для оценки качест- парате риэоторфине необходимо отдева в производстве бактериального лить клетки бактерий от частиц наполудобрения ризоторфина. нителя - торфа, что достигается приЦель изобретения - ускорение и уп- готовлением суспензии ризоторфина рощение способа. на 1 М-ном растворе поливиниловогоСпособ заключается в следующем, спирта, являющегося поверхностно-ак. Суспензию ризоторфина в 1 Х-ном 19 тивным веществом, при помощи которополивиниловом спирте фильтруют через го достигается иммобилизация бакте" бумажный Фильтр, центрифугируют, оса- риальных клеток со 1003-ным сохранедок клеток ресуспендируют в буферном кием их жизнеспособности и активносрастворе и инкубируют с субстратои . ти ферментов, в том числе и-глю-нитрофенилР-глюкопиранозидом 15 коэидазы. гидролизующимся Ферментом Я -глю- Пример 1, К 1 г бактериалькозидазой, в присутствии толуола в ного препарата ризоторфина для люцертечение 2 ч при 37 фС. Окрашенные ны вводят 10 мл 1 Е-ного раствора образцы фотометрируют при 430-440 нм поливинилового спирта на дистиллирона спектрометре (фотоэлектрокалори ванной воде и встряхивают на качал- метре) и нойученные значения оптичес- ке при 180 об/мин в течение 30 мин кой плотности сравнивают со значе- : при 28 С. Суспензию фильтруют через нием оптической плотности для суспен- бумажный фильтр на воронке Бюхнера эионных культур клубеньковых бактерий с водоструйным насосом, фильтратс известным титром жизнеспособных 25 разбавляют в 2 раза дистиллированной клеток. водой, центрифугируют при 7000 об/минТаким образом, сущность иэобрете- в течение 10 мин, осадок ресуспенния заключается в определении коли- дируют в 2,5 мл О, 1 М ацетатного бучества жизнеспособных Клеток клубень- фера (рН 6,5), добавляют 10 мкл то. ковых бактерий по их р -гликоэидаэ 30 луола, встряхивают при 180 об/мин ной активности, которая служит пока- в течение 20 мин при 28 С добавляют зателемих жизнеспособности. , О, 1 мл субстрата 4-нитрофенилРВ таблице приведены данные по опре- глюкопиранозида в О,1 И ацетатном буделению активности Я -глюкозидазы фера (рН 6,5 при концентрации субстра.в суспенэиойных культурах клубенько та 10 мг/мл), инкубируют 2 ч при вых бактерий люцерны при Прогревании 37 Со бактериальной суспенэии при 45 С в Фотометрирование проводят на спек- течение различных промежутков времени. трофотометре при 440 нм или на фотоуказанные культуры, таким образом, .электрокалориметре (зеленый свето- содержат .различные количества жизне-,щ 0 фильтр), Значение Е 4 . равно 0,30, способных клубеньковых бактерий чему что соответствует количеству жизнеспосоответствуют разные величины Ф -глю собных клеток 4,5 10 э в 1 г. козидазной активности, При посеве препарата на питатель Время прогре- Количество ную среду (контроль известным методом) вания при 45 С, жиэнеспособ- Ео 5 титр клеток равен 4,7 10 в 1.г,. Тамии ных клеток. ким образом, способ позволяет подув 1 мл сус- чить вполне достаточную точность прн пензииэначнтеАьном выигрьппе времени (3,5 чвместо 5 сут,)0 6П р н и е р 2 Опыт ставился точно так же, .но бьяк использован риэотор-. 15 5 10 . 0,48 ,Фин для люцерны, хранившийся в течение 3 иес. Предлагаемый способ пока 10 ф 0 20 зал значение 0,9 10 клеток в 1 г,9 обычным сдособои было получено зна-9 3 0 04 чение 1,0 10 клеток.П р и и е р 3. Опыт ставился точ 0 п 0 но так зй, но был взят рнэоторфинСоставитель Т.ПолянскаяТехред Л.Сердюкова Корректор, М,Пожо Редактор С.Рекова Тираж 366ВНИИНК Государственного комитета СССР цо делам изобретений я открытий 113035, Москва 3-35, Рауаская нвб., д, 4/5Заказ 3443 Подписное Производственно-пблнграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 314105184Фказал значение 7,2 10 Э клеток, иэ- от наполнителя, приготовление сусвестным способом было получено зна- пензии бактерий добавление субстра1 чение 7,4 10 . та, инкубирование полученной смесис последующей оцСнкой Результатов,. Таким образом, предлагаемый спо- о т л и ч в ю щ и Я с я тем, что, с соб позволяет производить экспресс-, целью ускорении и упрощения способа, оценку качества препарата риэоторфн- отделение клеток бактерий от,наполна цо содержанию в нем жизнеспособных нителя осуществляют раствором поли- клеток клубеньковых бактерий беэ при винилового спирта, перед введением менения какю-либо дефицитных и доро- субстрата в суспенэию бактерий ввогих приборов. Способ может быть твк- , дят тыуол, в качестве субстрата исае использован для анализа культу- польэуют 4-нитрофенил-Я-Ь-глюкопираноральных зядкостей, т.е. для контроля . знд, после инкубирования смеси опрев процесса ферментации. 15 деляюХ. оптическую плотность гидро"лизата, полученного в процессе инку Ф о Р и у л а н з о б Р е т е н и я бнрования смеси, путем фотометрнрования при 430-440 нм,. а оценку резуль;способ определения количества татов осуществляют путем сравнения оа. жизнеспособных клеток клубеньковых 20 тической плотности гидролизата с эта-,. бактерий в ризоторфине, цредусматри" донными суспензиями бактерий, содер" вающий приготовление суспензии Ризо" жвщих известное количество жизнеспо" торфинв, отделение клеток бактеРий собных бактерий.4