Способ определения повреждения клеток грамотрицательных бактерий

(51) СУДАРСТВЕННЫИ КОМИ О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ СССР КРЫТИ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ 2 г 10 М. Затем нпеременное электределяют отношенииентационного эф. на от 10 д ладывают поле. Оп электроо еск Бюл. Р 14 биологической фи оюзный научно-ис титут прикладной е величинсекта в пол икроство СС 4, 1973 во СССР )2, 198 е частот. 2 т АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯКЛЕТОК ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ(57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к технике анализаповреждения бактериальных клеток.Целью изобретения является повышениеточности определения поврежденияграмотрицательных бактерий, Для этого к клеточной суспензии добавляютдодецилсульфат натрия в концентрации мегагерцевых и килогерцевых частотв пробе и в контроле. Уменьшение этого отношения в пробе в сравнении сконтролем более чем на ЗОБ являетсякритерием определения повреждениявнешней мембраны грамотрицательныхбактерий. Определение величины электроориентационного эффекта в полемегагерцевых частот проводят на час.тоте, находящейся в диапазоне высокочастотного спада эффекта. Использование способа обеспечивает увеличение точности анализа эа счет выявления повреждения внешней мембраныклеточной оболочки при отсутствииповреждения цитоплазматической мембраны. Кроме того, дополнительноеувеличение точности анализа достигается эа счет оптимального выборачастоты поля в мегагерцевом диапазо1388425 15 20 ЗО 35 40 45 50 55 Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в промышленности для определения повреждения клеток на различных стадияхбиотехнологического процесса.Цель изобретения - повышение точности определения повреждения грамотрицательных бактерий,П р и м е р 1. В качестве моделиклеток с поврежденной внешней и неповрежденной внутренней (цитоплазматической) мембранами берут клетки,обработанные трилоном Б (динатриеваясоль этилендиаминтетрауксусной кислоты) в концентрации 10 М. Известно,что трилон Б в укаэанной концентрации вызывает повреждение внешнеймембраны клеток Е.со 1, не нарушаябарьерных свойств их цитоплазматической мембраны.Для определения повреждения клетокграмотрицательных бактерий Езсйег 1, сЬа со 11 Ктрилоном Б исходнуюсуспензию клеток дважды отмывают вдистиллированной воде с последующимцентрифугированием, помещают в трис-НС 1 буфер (10 М, рН 8,0) и делятна две части. Одну из них используютв качестве интактных клеток с неповрежденной внешней мембраной, а к другой добавляют трилон Б до конечной-гконцентрации 10 М. Обе части инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин,Затем интактные и обработанные.клетки дважды отмывают в дистиллированной воде с последующим центрифугированием и ресуспендируют в водеи задают следующие параметры суспензии; оптическая плотность 0,13 (длина световой волны 540 нм, толщинакюветы 1 см), удельная электропроводность 2,4 10 Ом м , рН 5,0,Затем каждый образец (интактныеи обработанные клетки) делят на двечасти. Одну из них используют в качестве контроля, а к другой добавляют додецилсульфат натрия в концент.-Ф- 4рации от 10 до 2 10 М,Додецилсульфат натрия (ДСН) широко используется в бактериологии длярастворения изолированных клеточныхстенок и цитоплазматических мембранс целью их последующего фракционирования, В предлагаемом способе введение ДСН в концентрации от 10 до210 М позволяет обнаружить повреж"дение внешней мембраны грамотричательных бактерий, без нарушения целостности клеток. Действительно,при обработке этих бактерий с неповрежденной внешней мембраной ДСН в-4концентрации 210 М и ниже не наблюдается нарушения барьерных свойств внутренней цитоплазматической мембраны, так как неповрежденная внешняямембрана является дополнительным барьером для ДСН и защищает цитоплазматическую мембрану от повреждающего действия этого поверхностно-активноговещества, Если же внешняя мембрана клеток повреждена, то ДСН нарушаетбарьерную функцию цитоплазматическоймембраны и значительно уменьшает величину отношения ЭОЭ в поле мегагерцевых и килогерцевых частот,Электроориентационный эффект клеток определяют на устройстве для контроля физиологического состояния клеток.С целью оптимального выбора частоты, при которой определяют электроориентационный эффект (ЭОЭ) в мегагерцевом диапазоне, вычисляют значе- ния относительного изменения величины отношенияЭОЭ клеток с неповрежденной внешней мембраной в мегагерцевом диапазоне к таковой в килогерцевом (10 Гц) диапазоне для разфных частот мегагерцевого диапазона, Полученные данные представлены в табл,1.Из табл,1 видно, что максимальное изменение относительной величины Ь/Ь, при добавлении додецилсульфата натрия имеет место в случае, если частота поля задается в области высокочастотного спада ЭОЭ, т.е. в6 7пределах 10 -10 Гц. В этом случае обеспечивается максимальная чувствительность при определении повреждения внешней мембраны клеток, повышается точность анализа.У клеток с неповрежденной внешней мембраной величина относительного измененияпри добавлении додецилсульфата натрия также изменяется из-за изменения электрических свойств клеток при адсорбции его на их поверхности. Однако у неповрежденных клеток Ь 3/ не превышает 207., в то время как у клеток с поврежденной внешней мембраной ь //3, составляетФ при концентрации ДСН 2 10 М и мега 6 7 герцевой частоте 10 - 10 Гц 39 76 Х.П р и м е р 2. Определяют повреждение бактериальных клеток Еяс 1 Гегс 1 да со 1 д Ктрилоном Б, Процедураи условия обработки клеток трилономБ такие же, как в примере 1. Параметры клеточной суспензии, установка дляпроведения измерений и последовательность операций аналогичны примеру 1,кроме концентраций додецилсульфатанатрия, которая в этом примере равна10 М. Результаты принедены в табл.1.В этом примере также повреждениявнешней мембраны клеток выявляютсяпри добавлении доцецилсульфата натрия 15и сопровождается уменьшением относительной величины 1 Гр/при мегагерце 6ной частоте поля в диапазоне 10710 Гц на 30-411,П р и м е р 3. Определяют повреждение бактериальных клеток ЕясЬегь. -с 1 Га со 1 Ктрилоном Б, Процедураи условия обработки клеток трилономБ, а также параметры суспензии, установка и последовательность операций 25такие же, как и в примере 1, кромеконцентрации додецилсульфата натрия,которая в этом случае равна 1,5.10 М.Результаты измерений приведены в -табл.1, 30Как видно из табл,1, и этом примере также выявляется повреждение внешней мембраны клеток при добавлениидодецилсульфата натрия и сопронаГщается уменьшением относигельной нели 35чины д/, при мегагерцевой частотеполя в диапазоне 10 -10 Гц на 34,5658,5%.Добавление додецилсульфата натрия-4н концентрации свыГпе 2 10 М приводит к недопустимо большому увеличению удельной электропронодности суспензии (до 10 Омм и вьГше),диапазон концентраций, позволяющихнадежно обнаружить повреждение внешней мембраны клеток, составляет от10 до 2 10 М.Из примеров 1-3 (см.табл.1) видно,что изменение ГГД//3, при введении додецилсульГ;)а . я ГГятрия В 1.Онцент рацииот 10 до 2 1 СИ на величину свьппе50307 служит надежньпГ критерием определения повреждения внешней мембраныграматрицательных бактерий,П р и и е р 4. Определяют понреж 55дение трилансм Ь штамма грамотрицатслтьГГГ.Гх бактерий, а именно ЕясЬегс 1 Га со 1. ИЗЕ, Процедура и условия обработки трилоном Б такие же,как в примере 1. Параметры анализируемых суспензий следующие: оптическая плотность 0,26, удельная электропроводность 2 10 Ом м , рН 4,7.Установка, на которой проводятизмерения, и последовательность операций аналогичны примеру 1,Результаты приведены в табл,2,В примере 4 повреждение внешнеймембраны клеток выявляется г.ри добавлении додецилсульфата натрия и сопровождается уменьшением относительной величины й/ более чем на 307,а именно в области высокочастотногоспада электроориентационнага эффектапримерно на 607,Таким образом, использование предлагаемого способа определения повреж-.дения клеток грамотрицательных бактерий обеспечивает увеличение точности анализа за счет выявления повреждения внешней мембраны клеточнойоболочки при отсутствии поврежденияцитоплазматической мембраны. Крометого, дополнительное увеличение точ-.ности анализа достигается путем увеличения чувствительности (примернов 2 раза) измерений за счет оптимального выбора частоты поля в мегагерцевом диапазоне частот (в области высокочастотного спада электроориентационного эффекта).формула изобретенияСпособ определения повреждения клеток граматрицательных бактерий, включающий помещение исследуемых и эталонных образцов клеточных суспензий в переменное электрическое поле, определение величин электроориентационнаго эффекта в поле мегагерцевых и килогерцевых частот с последующей оценкой по отношению измеренных величин, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности определения, перед помещением в пол". в образцы вводят додецилсульф фат натрия в концентрации 10-42 10 М, причем величину электроориентационного эффекта в поле мегагерценых частот определяГат на частоте, находящейся в диапазоне высокочастотного спада эффекта.1388425 Т а б л и ц а 1 КонцентраЧастота в мегагерцевом диапазоне, Гц Клетки ция додецилсульфата натрия,М 5 10 10 5 10 10ь(3 7 р у о-4 2 .10 1,60 261,29 39 0,29 77 0,14 76 П р и м е ч а н и е, 43 - абсолютное изменение величины / у обработанныхдодецилсульфатом натрия клеток по сравнениюс величиной 3 для контрольных клеток.Таблица 2 Частота в мегагерцевом диапазоне, Гц Концентрациядодецилсульфата натрия,М Клетки 10 510 10 ье ее ееее %9 йР ьР.1,90 1,16 1,56ъ 1,80 Клетки с поврежденнойвнешней мембра- ной 2 "10 58 0,46 60 35 0,65 1, 17 Редактор Н,Киштулинец Заказ 1549/28 Тираж 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская йаб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 неповрежденнойвнешнеймембранои поврежденной внешней мембраной 168 2175 138 345 035 62Составитель А.ФедоровТехред А,Кравчук Корректор А,Тяско 0,610,25 58,5 1,251,27 2