Способ получения фосфорибулокиназы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК ЯО.1154329 4 а) С ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ СОБ П АЗЫ пу и, насыщ ьтрации отличаю я способ продукта , а ионоо аминоэт ОЛУЧЕНИ тем гомоге ения сульф и ионообм щийся тем а и повышиспольз бменную х илцеллюло ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт физиологии и биофизики растений АН Таджикской ССР(56) 1. КасМег Е. ТЬе гедцс 6 че реп 1 озе рЬоврЬа 1 е сус 1 е. 1. рЬозрЬог 1 Ьц 1 оЫпаае апд ПЬц 1 озе йрЬозрЬа 1 е сагЬоху 1 азе. - АгсЬ. ВюсЬегп, ВюрЬуз 1957, 69, р. 300/310.2. ЯаЬаз А, Й., ЖаИсег О. А. 1 пЬЬИюп о Зр 1 пасЬ рЬозрЬог 1 Ьц 1 оЫпааве Ьу РХ-д 1 цсега 1 де Ьуде. - ВюсЬев .1 1976, 153, р. 613 - 619.(54) (57) СПОРИБУЛОКИНстьев растениния, гель-филматографии,лью упрощенида целевогорусских бобовфию на диэтилдважды. Я ФОСФО- низации лиатом аммоенной хрочто, с цеения выхоуют листья роматогразе проводятИзобретение относится к производству ферментов, а именно к технологии их получения и может быть использовано для получения ценного реагента - рибулозо,5-дифосфата и при создании искусственной системы для моделирования работы карбоксилирующей фазы фотосинтеза.Известен способ получения фосфорибулокиназы из листьев шпината. Способ предусматривает гомогенизацию 8 кг листьев шпината, двукратное насыщение полученного сока сульфатом аммония (17 - 40 Й), двукратное осаждение охлаждаемым ацетоном (40 - 50 й), снижением рН среды до 4,5, двукратным осаждением сульфатом аммония (35 - 55/) и вновь дробным осажде нием сульфатом аммония (25 - 45/ю) 1.Однако этот способ предполагает использование значительного количества исходного материала (листьев шпината), больших объе мов гомогената (до 5 л) и многократное фрикционирование сульфатом аммония, что приводит к значительным потерям фермента в процессе очистки.Известен также способ получения фосфорибулокиназы из листьев шпината путем их гомогенизации, насыщения сульфатом 2 Б аммония, гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Способ включает экстракцию листьев шпината в трис-НС буфере рН 8,1, двукратное насыщение сульфатом аммония (30 - 60 й), экстрагирование ацетоном, охлажденным до -20 С (30 - 50/о), новое насыщение сульфатом аммония, до 55/, гель-фильтрацию через сефадекс б - 200, насыщение сульфатом аммония до 75/, гель-фильтрацию через сефадекс б - 25, ионообменную хроматографию через диэтиламиноэтилцеллюлозу 2.Известные способы сложны и обеспечивают недостаточно высокий выход целевого продукта.Целью изобретения является упрощение способа и повышение выхода целевого про дукта.Указанная цель достигается тем, что при способе получения фосфорибулокиназы путем гомогенизации листьев растений, насыщения сульфатом аммония, гель-фильтрации 4 и ионообменной хроматографии используют листья русских бобов, а ионообменную хроматографию на диэтиламиноэтилцеллюлозе проводят дважды,Пример. 400 г,свежесобранных листьев двухнедельных растений русских бобов промывают холодной водопроводной водой и спо ласкивают дистиллированной водой. Остатки воды удаляют с листьев фильтровальной бумагой. Затем в холодной комнате при 4 С листья измельчают в размельчителе тканей РТ - 1 в присутствии 400 мл трис-НС буфера 0,05 М рН 8,0. Полученную суспензию фильтруют через четыре слоя марли. Этот гомогенат центрифугируют при 10 000 ц 1 = 0 С на центрифуге ЧАС. Супернатант насыщают сульфатом аммония до 30/ю и центрифугируют при тех же условиях. Оса док отбрасывают, а супернатант насыщают сульфатом аммония до 60 й и вновь центрифугируют при тех же условиях, Полученный осадок растворяют в минимальном объеме (10 мл) того же буфера. Этот раствор наносят на колонку с сефадексом 0-50. Размер колонки 2 х 30. см. Белок с колонки элюируют тем же буфером. Собранный обессоленный белок наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (2,5 Х 14 см). Затем через эту коленку пропускают 300 мл 0,05 М трис-НС буфера рН 8,0 с градиентом КС 10,02 - 0,2 М. Фракции, обладающие активностью фосфорибулокиназы, насыщают до 75/ю сульфатом аммония, затем центрифугируют. Осадок растворяют в минимальном объеме (5 мл) того же буфера и наносят на колонку с сефадексом 6-25 (2 Х 30 см), Собранный обессоленный белок наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (2,5 Х 14 см) и проводят ионообменную хроматографию, как описано, используя трис-НС буфер 0,05 М рН 8,0 и градиент концентраций КС 0,02 - 0,2 М.В таблице приводятся характеристики ферментов, выделенных по предлагаемому и известному способам.Полученный препарат характеризуется однородностью при электрофорезе в 5, 7,5 и 1 О/ц-ных полиакриламидных гелях, имеет характерную молекулярную массу в 250 000 дальтон.Предлагаемый способ позволяет повысить выход, фосфорибулокиназы и сократить количество стадий выделения.1154329 Способ Показатели Предлагаемый Известный Удельная активностьФермента в листьях,нкат/мг общего белка 0,24 0,36 Количество очищенного Фермента на 1 глистьев, мг 0,075 О, 012 Количество очищенного Фермента на 1 гобщего белка экстракта 0,0071 0,0023 Электрофоретическаяоднородность Удельная активность,нкат/мг,белка 58 Количество растительного материаладля получения 1 мгочищенного Фермента,г 14 83 Редактор О.ЮрковецкаяЗаказ 2633/24 Составитель Н. Гуляева Техред И. Верес Корректор А. Зимокосов Тираж 525 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4