Способ определения динамики таксиса микроорганизмов

(54) СП ТАКСИСА (57) Из логии и определорганизм ии,АРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТ(71) Институт биохимии и физиологиирастений и микроорганизмов АН СССРи Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского(56) Авторское свидетельство СССРУ 1154326, кл, С 12 М 1/00, 1985СОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИНАМИКИМИКРООРГАНИЗМОВбретение относится к микробиоможет быть использовано дляния динамики таксиса микроов в применении к биотехнолольскохозяйственной микробиологии и медицинским исследованиям, Целью изобретения является повышение точности определения таксиса микроорганизмов, Способ заключается ,в том, что суспензии микроорганизмов, помещенных в кювету спектрофотометра, создают горизонтальный градиент раздражителя путем нанесения на боковые нерабочие стенки кюветы слоя геля, не перекрывающего световой пучок и содержащего раздражитель, затем фотометрируют свет, проходящий через суспензию, определяют значения скорости перемещений микроорганизмов по изменению их концентрации и о динамике таксиса судят по полученным зна- с чениям скорости перемещения, Наилучшие результаты получаются при спектротурбидиметрическом определении концентрации микроорганизмов. 3 ил,50 1 3355 бИзобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения динамики таксиса микроорганизмов в применении к биотехнологии, сельскохозяйственной микробиологии, а также к медицинским исследоваНиям.Цель изобретения - повышение точности определения таксиса. 10На фиг.1 показана кювета с нанесенным на боковые стенки гелем, продольный разрез; на фиг.2 - зависимость оптической плотности от времени для суспенэии клеток Акоярг 111 пш Ъгая 11 епяе в контрольном опыте (1) и в градиенте Р-фруктозы при ее начальной концентрации 10 м (11); на фиг.З - зависимость концентрации сухих веществ клеток от времени для 20 суспензии клеток Акоярг 11 жп Ъгая 1.- 1 епяе в контрольном опыте (1) и в градиенте фруктозы при его начальной концентрации 10 4 м (11).Кювета содержит боковые (нерабочие)25 стенки 1, на которые нанесены слои 2 геля, зону 3 светового пучка, дно ч,В предлагаемом способе создают двусторонний горизонтальный градиент. Преимущество двустороннего горизонтального градиента перед односторонним вертикальным заключается в том, что вертикальный градиент совпадает по направлению с градиентом кислорода, образующимся в кювете, Поскольку подавляющее большинство микроорганизмов проявляют таксис не только ца химические раздражители, но и на кислород, ориентация клеток в вертикальном гра- диенте может быть вызвана реакцией не на раздражитель, а на кислород, В предлагаемом способе создаваемый градиент является горизонтальным и не совпадает по направлению с градиентом кислорода. Фактически в кювете создаются два градиента одинаковые по составу и концентрации, но противоположные по направлению (оба градиента направлены в центр кюветы), что повышает точность определения таксиса, путем снижения вероятности ошибки.Кроме того, в предлагаемом способе определения динамики таксиса микроорганизмов определяют скорость перемещения клеток под влиянием раздражителя по концентрации сухих веществ клеток, получаемой спектротурбидиметрически. б 2Изменение скорости премещенияклеток через изменение их концентрации можно проводить любыми оптическими измерениями, позволяющими, впринципе, получить такую информацию:фотометрическими, нвфелометрическими,спектротурбидиметрическими, Последниеизмерения являются более точным, ноне обязательным элементом,Способ осуществляется следующимобразом,Динамику таксиса регистрируютс помощью спектрофотометра, В эксперименте используют контрольную кювету и ряд опытных для исследованияразличных концентраций раздражителя,Сначала готовят контрольную кювету,На боковые нерабочие внутренние стенки кюветы наносят ровный слой нетоксичного для микроорганизмов геля, Например, гель можно наносить в расплавленном состоянии с помощью пипетки или автоматического дозатора, Дляэтого кювету помещают горизонтальнона боковую поверхность, наносят жидкий гель, а после затвердения геля.кювету переворачивают и наносят такое же количество геля на противоположную стенку кюветыОбъем наносимого геля подбирают так, что он покрывает ровным слоем всю поверхностьбоковой стенки кюветы, но слои геляне перекрывают световой пучок, проходящий через кювету (фиг,1),После затвердевания геля на боковых стенках кювету заполняют суспензией микроорганизмов с оптической плотностью, соответствующей режиму работы спектрофотометра (О,З-О,б), облучают лучом фотометрической системыспектрофотометра, проводят измерениеоптической плотности в зависимости отвремени, Учитывая, что изменение оптической плотности прямо пропорционально изменению концентрации микроорганизмов, строят график зависимости оптической плотности от времени и по этому графику определяют относительнуюскорость перемещения микроорганизмов(как тангенс угла наклона касательнойк оси абсцисс), Определенная, такимобразом, скорость перемещения микроорганизмов в контрольной кювете является постоянной и вызвана только седиментацией клеток,Далее проводят измерения в опытнойкювете, Подготовка кюветы к эксперименту и методика измерений отличаетсяот контроля только тем, что перед нанесением геля на боковые стенки кюветы в него вводят исследуемый раздражитель. Все остальные процедуры оста 5ются неизменными, Проводят измере ния для всех имеющихся концентраций.раздражителя. Поскольку в опытахсоблюдены все те же операции, чтои в контроле, за исключением добавления раздражителя, изменение скоростиперемещения микроорганизмов по сравнению с контролем является однозначной характеристикойтаксиса,Способ основан на способности микроорганизмов перемещаться по направлению к возрастающей концентрации положительного раздражителя (аттрактанта) и от убывающей концентрации отрицательного раздражителя (репеллента). 0Если на боковые стенки кюветы наносится гель (твердая среда) с раздражителем, а сами кюветы заполняются суспензией микроорганизмов, раздражительдиффундирует из твердой среды (гель) 25в жидкую (суспензию), причем его градиент направлен от боковых стенок кцентру кюветы, т,е, к зоне сВетовогопучка, Если раздражитель являетсяаттрактантом, микроорганизмы переме- З 0щаются из центра кюветы в обе стороны к боковым стенкам (в сторону возрастающей концентрации) и выходятиз зоны светового пучка, что регистрируется прибором, Если раздражительявляется репеллентом, микроорганизмы перемещаются в сторону убывающей концентрации, т,е, от боковыхстенок к центру - в зону световогопучка, Прибор регистрирует увеличение численности микроорганизмов,Наилучшие результаты получают,если перемещение клеток определятьпо концентрации сухих веществ клеток,определяемой спектротурбидиметрически,Для этого измеряют значения оптичес-кой плотности не при фиксированномзначении длины волны, а при пяти значениях длинволн (400, 450, 500, 550 и50600 нм), Далее производят расчетспектротурбидиметрнческих данных,например, с помощью мини- илимикро-ЭВМ, Рассчитанная концентрациясухих веществ клеток является одно-.55эначной характеристикой концентрацииклеток, по изменению которой с максимальной точностью судят о скорости перемещения клеток,П р и м е р, Определяется наличиехемотаксиса у бактерий Агояр 1 г 11 цшЪгая 11 епяе яр 7, На фиг,2 приведеныграфики зависимости оптической плотности от времени для суспенэии бактерий в градиенте фруктозы. Концентрация фруктозы в геле составляет 10 м.-4На фиг.3 приведены графики зависимости концентрации сухих веществ клетокот времени для тех же условий эксперимента. Как следует из приведенныхграфиков, скорость перемещения клеток, определенная через изменение оптической плотности как тангенс угланаклона касательной к оси абсцисс,составляет в контроле 2,5 10 " мин-,а в опыте 2 10мин-. Таким образом,скорость перемещения клеток в градиенте фруктозы увеличивается в 8 раз.Скорость перемещения клеток, определенная через изменение концентрациисухих веществ клеток (также, кактангенс угла наклона касательнойк оси абсцисс), составляет в контроле 5 О г/см мин , а в опыте-у5.10 г/сммин-, т.е, в градиентефруктозы скорость перемещения клеток увеличивается в 10 раэ,Из указанного следует, что хемотаксис у исследуемых бактерийАгояр 1 г 111 ит Ъгая 11 епяе есть формыкривых изменения оптической плотности и концентрации сухих веществ клеток в контроле и в опыте существенноотличаются, скорость перемещенияклеток в градиенте раздражителя внесколько раэ вышее, чем в контроле,скорость перемещения клеток, выраженная через изменение концентрациисухих веществ клеток, более точный критерий,чем скорость, выраженная черезизменение оптической плотности.Способ не сложен в эксплуатации,осуществим в условиях любой микробиологической и биохимической лаборатории, поскольку не требует сложного,дорогостоящего и дефицитного оборудования. При условиях осуществленияспособ обладает высокой точностью,поскольку отсутствует визуальная оценка параметров, Повышение точности следует понимать в двух аспектах: в предлагаемом способе реализуются условиядля определения динамики перемещениямикроорганизмов и для количественнойхарактеристики используются спектротурбидиметрические измерения, болееточные, чем простые измерения, оптиг ю г.Я Ч юг. Р смл, мин л, мин ставитель О,Борисовахред В. Кадар Корректор А,Обручар Редактор И.Г Заказ 4018/2 ная Тираж 499 НИИПИ Государственного комитета ССС по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская набодписно Про ул, Проектная, 4 дственно-полиграфическое предприятие, г, Уж 51335566 б ческой плотности или рассеяния при од ч а ю щ и й с я тем, что с целью ной длине волны света., Способ не выповышения точности определения таксиэывает сложности в его внедрениив са, градиент раздражителя создают гореализуется с помощью серийных спект- ризонтальным с двух сторон по направрофотометров и мини- или микро-ЭВМ.5лению к световому пучку, проходящемучерез суспензию микроорганизмов, пу- Ф о р м,у л а и з о б р е т е н и я тем нанесения на боковые нерабочиеСпособ определения динамики так- стенки кюветы слоя геля, ие перекрываю- сиса микроорганизмов, включающий соз о . щего пучок света и содержащего раздражи.дание градиента раздражителя в суспентель, затем определяют скорость перезии микроорганизмов и фотометрирова мещения клеток по изменению их конине света, прошедшего через суспенцентрации и о динамике таксиса судят зию микроорганизмов, помещенную впо полученным значениям скорости пекювету спектрофотометра, о т л и +15 ремещения клеток