Способ определения метаболитов витамина д в сыворотке крови

%Рю;Мд ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИН АВТОРСНОМУ СВИДЕТВЪСТВУ(ЛИТпн ГОСУДАРСТВЕННЬЙ КОМИТЕТ СССР. ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГПЙ(71) Институт питания АМН СССР(56) 1. Сх 1 Ьеггвоп Т., Бггуй К.Р.Н 1 яЬ-Регйопаапсе Ерп.й сЬогошагодгарЬус Аввау Гог 25-Нуйгохучдгаш 1 пР дп Бегпш. "С 1 ипса 1 СЬеш 1 вйгу",1977, ч. 23, р. 1700-1704,(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОВ ВИТАМИНА Р В СЫВОРОТКЕ КРОВИ и добавления к образцу внутрен- стандарта, экстракции липидной фракции, хроматографической очисткина колонке с силикагелем с последующей элюцией и высокоэффективнойжидкостной хроматографии, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения способа, в качестве внутреннего стандарта используют 17-ацетат эквиленола, а элюцию с колонкис силикагелем проводят последовательно смесью гексан:хлороформ вобъемном соотношении 100:2, смесьюгексан:хлороформ:уксусная кислотав соотношении 100:10;2, хлороформом,смесью хлороформ:ацетон в соотношении 100:10 и смесью хлороформ:ацетон:уксусная кислота в соотношении50:50:1.1140Изобретение относится к аналити"ческой химии и может быть использовано в биохимии при исследованияхметаболитов витамина Э.В настоящее время известно околодвух десятков метаболитов витамина Р. Предлагаемый метод относитсяк определению трех важнейших из них,Это 25-оксихолекальциферол/25 (ОН)Р/,1,25-диоксихолекальциферол/ " 1 О1,25(ОН) Р/ и 24,25-диоксихолекальциферол/4,25(ОН)0 /. Эти веществаявляются биологически активными формами витамина Э в организме человека.Известен способ определения метаболитов витамина Р в сыворотке кровипутем добавления к образцу внутреннего стандарта, экстракции липиднойфракции, хроматографической очисткина колонке с силикагелем с после Одующей элюцией и высокоэффективнойжидкостной хроматографии. Способзаключается в добавлении к 1 мл сы- .воротки меченого тритием стандарта./3 Н/ - 25-оксихолекальциферола и 25последующей экстракции образцасмесью хлороформ-метанол (2:1),Затем экстракт очищают на микроколонке с силикагелем 0,5 2 см. Первуюфракцию элюируют 2 мл гексана, вторую фракцию 7 мл смеси хлороформ-гексан (3:2). Эти фракции отбрасывают.Метаболит элюируют 7 мл смеси хлороформ-гексан (3:2). Образец упариваюти определяют концентрацию 25(ОН)З35помощью высокоэффективной жидкостнойхроматографии и изотопного анализа Г 1 Д.Недостатком известного способаявляется его сложность и длительность. 4 ОЦель изобретения - упрощение способа. Указанная цель. достигается тем, что согласно способу определения метаболитов витамина 2 в сыворотке крови путем добавления к образцу внутреннего стандарта, экстракции липидной фракции, хроматографической очистки на колонке с силикагелем с последующей 3 люцией и высокоэффек О тивной жидкостной хроматографии, в качестве внутреннего стандарта ис" пользуют 1-ацетат эквиленола, а элюцию с колонки с силикагелем.проводят последовательно смесью гексен: 55 хлороформ в объемном соотношении 100:2, смесью гексан:хлороформ;уксусная кислота в соотношении 1.00:10:2,039 2хлороформом, смесью хлороформ:ацетон в соотношении 100:10 и смесью хлоро-; форм:ацетон;уксусная кислота в соотношении 50:50:1. П р и м е р. К 1 мл исследуемой сыворотки крови добавляют 25 мг 17-ацетат эквиленола в 100 мкл этанола и перемешивают в течение 10 мин. Затем проводят экстракцию, добавляя 3,75 мл смеси гексан-изопропанол (1:2), 5 мин перемешивают и добавляют еще 1,25 мл гексана, и после тщательного перемешивания центрифугируют при 1000 об/мин 10 мин.Органическую фазу отбирают, а остаток экстрагируют гексаном (1,25 мл х 2) . Объединенный экстракт упаривают и переносят на микроколонку в гексане (0,25 мл,х 2). Предварительную очистку проводят на автоматическом процессоре образцов РНЕРфирмы Эц РопГ 3 псггцшепгз (США) с двенадцатиколончатым ротором с модифицированными стеклянными колонками ббх 3 мм на силикагеле КБ 1 Ь РКЕРБЕЬ 1 СА с диаметром частиц 25-40 мкм фирмы А 11 гесЬ Аззосдагез (США) при скорости1000 об/мин 4 мин. Первую фракцию элюируют 2 мл смеси гексан-хлороформ (100:2); вторую 2 мл смеси гексанхлороформ-уксусная кислота (100: 10:2); третью фракцию, содержащую 25(ОН)Э , элюируют 2 мл хлороформа, четвертую фракцию 2 мл смеси .хлороформ-ацетон (100:10), 1, 2 и 4 фракции отбрасывают. Пятую фракцию, содержащую 1,25(ОН) П и 24,25(ОН) П,5 элюируют 2 мл смеси хлороформ-ацетон- -уксусная кислота (50: 50: 1) . Фракции, содержащие метаболиты, упаривают досуха под вакуумом при температуре не более 40 С, переносят в конические флаконыОобъемом О, 3 мл, перерастворяют в 50 мкл смеси гексан.-изопропанол (90;10) и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе 322 МР, АПЕК (США) на колонке ц 1 ггазрйеге Б 1 (5 мкм 4 бх 250 мм). Детектирование при длине волны 265 нм. Элюирующая система гексан-изопропанол (90:10), Расчет осуществляют по калибровочному графику. Для его построения определяют отношение высот пиков 25(ОН) П. и 17-ацетат эквиленола призначениях 25 (ОН) 0, равных 5 нг, 10 нг,25 нг, 50 нг и 100 нг В данном примере отношение высоты. пика 25(ОН)П.у к высоте пика 17-ацетат эквиленола равно1140039,По калибровочному .графику определяют концентрацию 25(ОН)0 равную29 нг/мл.Другие примеры определения концентрации 25(ОН)П с помощью описанного метода представлены в таблице.( 3Высота пика 25(ОН)Р Концентрация25(ОН)Ро , определенная методом ВЖХ,мг/мл Истинная концентрация25(ОН)П, мг/мл Образец 10 10,5 20 21 26 30 31 41 50 50,5 60 60 70 70,5 80 80 10 По сравнению с известным предлага. емый способ обеспечивает упрощение, сокращение времени анализа, возможСоставитель Н. ГуляеваРедактор Т. Колб Техред А.Кикемезей Корректор И. Муска Заказ 256/34 Тираж 897 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Высота пика 17-ацетат эквкпенола47 мм---= 0,6572 мм ность максимальной автоматизации и повьппение достоверности получаемых результатов