Способ получения бактериальной биомассы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 9) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР " ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ПИС ИЗОБРЕТ ОМ А есс ведут бавления, А. А. Аавик.; Ч, Микелызавумнческой и бой ССР логиче скоп 1 сгоЬ)ооеу др. Синтез О-рибулозонзованной ферментнотеряй. - "Прикладнаяогня", 1979, т. ХУ, в 1,5- сисбио. АКТЕРИАЛЬщивания культу .на питатель НО, КНЩ, условиях, о тчто, с целью по-.(71) Институт хифизики АН Эстонск(56) 1, Со 1 Ьз Ч. 61969, Ч. ЗВ, 8 1-522. Хата М, Э. нднфосфата иммобилтемой тионовых бакхимия и микробнолс, 686-692.(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯНОЙ БИОМАССЫ путем вырары 1 Ъ 1 оЬаеИЬз ТЬ)оохйапа 58 йиой среде, включающей йа 80ИНО и МОС 16 НО, в аэробныхличающиися тем,151) С 12 й 1/20; С 12 й 1/07 вышения выхода биомассы, проц впроточном режиме при с)еоРости раз(ЙН 4)з Мо 04. (0,2-0,3) 10 фСнО 4 ф 5 НзО (0,13-0,17) 10СоОз (0.09-011) 10 аи процесс ведут при аэрации воздухом, обогащенным СОз до концентрации 6-8%.Изобретение относится к получению бактериальной биомассы путем выращивания тионо. вых бактерий, в частности штамма ТЬоЬас 1- 1 оа й 1 оохЫапа 588, применяемого в качестве источника ферментов при синтезе биологически активного вещества Р.рибулозо.1,5-дифосфата.йолучение О-рибулозо,5-дифосфата иэ Р-рибозо.5-фосфата и аденозин-трифосфата (АТФ) протекает в две стадии с участйем 1 О ферментОв рибозофосфатизомеразы (Р-рибо.эо 5 фосфат кетол.нзомераза, КФ 5,3.1.6) и 1 фосфорибулокиназы (АТФ: Р-рибулозо 5-фосфат.1-фосфаттрансфераэа, КФ 2.7.119). В клетках тионовых бактерий ТЫоЬас 1 Ца15 тпЬьхЫапа 58 В активности указанных фермен- . тов достаточно высоки и бесклеточный экстракт бактерий можно применять для проведения синтеза в промышленном масштабе, Кроме того в клетках названных тионовых бак терий отсутствуют фосфатазы, которые гидролизуют-эфиры фосфорной кислоты.Тионовые бактерии ТЬ 1 оЬас 1 ив 81 оохЫапа 58 Я являются автотрофиыми организмами, ко-торые используют в качестве источника энер- .5 гии соединения серы, а все органические вещества синтезируют из углекислого газа, при. сутствующего в воздухе аэрации.Известен способ получения бактериальной биомассы путем выращнвания тионовых бактеО .рий группы ТЬ 1 аЬасца на среде, содержащей микроэлементы, Нрнменение в этом спо. собе среды выращивания тионовых бактерий с содержанием растворенных в дистиллирован. ной воде микроэлементов в следующих концентрациях, мг/л: ИаС 300; Н 1 С 0,021;С 08045 НгО Чз 08 ь Еп 804 ф 7 Нг О 0,106;НзВОз О.б А 1 г(0 е)з 0123; ЮС 1 гфбНгО 0,11, Со 80 дф 7 НгО 0,109; Т 1 С 14 0,06; КВг 0,03; К, 0,03; МцС 14 НгО 140, Мп 80 Х х 7 НгО 0,629; ЗпС 1 гф 2 НгО 0,036; Ре 80 к Х 7 НгО 0,3 не обеспечивает достаточно высокой урожайности биомассы культуры 11.Наиболее близким к предлагаемому по :технической сущности и достигаемому реэуль. тату является способ получения бактериаль:ной биомассы путем выращивания культуры ТЬ 1 оЬасИва тЬ 1 оохЫапв 58 й на питательной среде, содержицей в 1 л водопроводной во. ды,.г: ЙагВгОзф 5 йгО 5; СЯНг 04 5; НАС 0,5; МЯСгфбНгО 0,1; КНгР 04 3,0 в аэробЯ ных условиях, Процесс ведут в периодической культуре с непрерывной аэрацией (обычно - с интенсивностью. 2 мз/ч в 20-литровых бутыпях в течение 4-5 сут при комнатной температуре). Клетки бактерии выде.ляют иэ культуральиой жидкости центрифу гированием, Выход сырой биомассы О,5-0,8 гс 10 л культуральной жццкостн 12).Недостатком известного способа является низкая урожайность бактериальной культуры, т.е, недостаточно высокий выход биомассы.Цель изобретения - повышение выхода биомассы.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения бактериальной биомассы путем вырицивания культуры ТЬ 1 оЬас 11па 161 оохдапв 58 й на питательнон среде, включающей йаг 8 гОз ф 5 НгО; КН,РО 4, йН 4 С и МВСг 6 НгО, в аэробных условиях, процесс ведут в проточном режиме при ско. рости разбавления 0,1-0,15 на среде, допол. нительно содержащей СаС 1 г 4 НгО, Н,ВО РеСз е 6 НгО, Еп 8047 Нг О, Мп 804 4 Н, О, СоСг, (йН ) МоО, Со 80 ф 5 Н О, ь 1 а НРО Й 2 НгО, при следующем соотношении ингредиентов, (г/л воды): Маг 8 гОз5 НгОКН,РО,Наг НРОе 12 Н, ОйН СМпСгбНг ОСас4 нг ОЕеСз 6 НгОЕп 80 ф 7 НгОМп 80 4 Нг ОН 3803(0,09 - 0,11) " 10 и процесс ведут при аэрапии воздухом, обогащенным СОг до концентрации б - 8%.Способ осуществляется следующим образом.Выращивание проводится в ферментере в проточном режиме с непрерывной аэрацией при рН 3,2 в среде указанного состава. Про. дувание воздуха, обогащенного углекислым газом (не более.чем 10%), проводят со скоростью, обеспечивающей концентрацию кисло-рода в культууальной жидкости в пределах 10 - 20% от насыщения, рй культуральной жидкости поддерживают автоматически при помощи 1 М раствора карбоната калия, равным 3,2. Темпеувтура выращивания бактерий 28 С. Скорость разбавления в проточном режиме, т,е, соотношение потока питатеяьной среды в час и общего обьема культуральиой жндкоети в ферментере, находится в пределах 0,1-0,15, Скорость перемешивани 100 а 00 об/мин.Интенсивный рост бактерий характеризует. ся концентрацией кислорода 10 - 20% от насыщения, постоянным расходом раствора карбоната калия и оптической плотностью культуры 0,38-0,41 при 540 нм,Биомассу отделяют от культуральной жнд. кости центрифугированнем. Выход сырой био51 О15 30 35 40 ВНИИХИ Заказ 1104/29 Тираж 525 Поднисиое. Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, уп, Проектная, 4 3 1массы 7-8 г на 10 л культуральной жидкости.П р и м е р, Культуру тионовых бактерий ТЬ 1 оЬзс 111 пв тЫоохЫапв 58 В выращивают в колбах на 2 л в жидкой среде сле.дующего состава (среда Эмото): йзг 8 гОгх 5 НгО 5 г; СаНР 04 5 г; КНгРО 4 3 г;ЙИ 4 С 0,5 г; М 9 С 1 гф 6 НгО 0,1 г, вода водопроводная 1 л. Обьем среды в колбе1,5 л. Время культивирования при постоянной аэрации при комнатной темнервтуре3 сут. Эта культура используется в качестве материала для засева ферментера.Ппименяют фермептер Ультроферм 1601(ЛКБ, Швеция) на 5 л, снабженный системами поддерживания температуры и рН среды,системой подачи среды, аэрации и перемешиваиия и электродом измерения концентрациикислорода, Фермеитер наполняют 3 л средыв дистиллированной воде, содержащеййагЗгОз 5 йгО 10 г/л; КНгРО 4 2 г/л;ИзгйРО 4 12 НгО 1 г/л; МН 4 С 0,5 г/л;раствор микроэлементов 1 мл/л. Такую жесреду применяют и в проточном режиме.Раствор микроэлементов содержит в 100 млдистиллированной воды СаСг 4 НгО 2 г;НзВОз 30 мг; МЯСг 6 НгО 10 г, РвС 1 гХ6 НгО 270 мг, Еп 80 .7 НгО 72 мг; ЬЬ 8044 НгО 55 мг; СоС 1 г 10 мг, (НН 4)гМо 0425 мг; Сц 804 ф 5 НгО 0,15 мг,Ферментер стерилиэуют при 110 фС в течение 20 мин. В отдельной колбе стернлизуятт1 М раствор карбоната калия, который служит титрантом для поддерживания рН вферменте ре,Ферментер засевают через систему подачисреды 1 л посевного материала иэ 2 литро.вой колбы. Температура в ферментере -о28 С. После засева азрацию и неремешиваиие поддерживают .на минимальном уровне -концентрация кислорода до 60% от насыщения и скорость неремешивания 50 об/мин.Начало интенсивного роста бактерий (черезсутки) характеризуется понижением рН. и концентрацни кислорода и повышением онтичес.кой плотности при 540 нм.При понижении рН культуры до 3,2 включают автоматическую систему подтнтровкинри помощи 1 М раствора карбоната калия,поддерживая величину рН постоянной, и подачу свежей среды со скоростью 50 мл/ч. 067038 4 При понижении концентрации кислорода по.вышают интенсивность аэрации до 10 л/мии,повышая в то же время содержание СОгв продуваемом воздухе до 6 - 8%, Скороспнеремешивания находится в пределах 100 -400 об/мин. При повышении оптической плотности культуры бактерий при 540 нм до 0,38(оптическая плотность определяется методомотбора проб на спектрофотометре "Спектро.мом" (Венгрия) скорость потока среды постепенно увеличивают от 50 до 600 мл/ч, Интенсивный рост бактерий в проточньл усло.виях характеризуется постоянным расходомраствора карбоната кзлия для поддерживания рН культуры, концентрацией кислородав пределах 10-20% от насыщения и оптичес.кой плотностью при 540 нм 0,38 - 0,42. Клетки бактерий отделяют из культурвль.ной жидкости центрифугированием на цент.рифуге К(Янецки, ГДР) при 5000 об/мин.;Выход сырой биомассы составляет 16 г иэ20 л культуральной жидкости. Использование изобретения обеспечивает повышение урожайности бактериальной куль.туры до 15 раз, а суммарная активность фер.ментов, превращающих О-рибозо-фосфат зприсутствии АТФ в О.рибулозо,5 дифосфатувеличивается до 20 раэ по сравнению с про. тотипом. Достигается хорошап воспроиэводимость при выращивании бзктерий. Ферментер может работать непрерывно по меньшей мере 1 мес, Полученная за это время масса бакте. рий составляет 300 г. В соответствии с рег. лвментом производства О-рибулоэо.1,5-днфосфвтв для получения 1 г О-рибулозо,5.дифос. фата требуется фермептный пренарвт из 3,6 г сырой бактериальной массы. Обьем пронзвод. ства О-рибулоэо,5-дифосфата составляет приблизительно 15 г в год. Необходимая для этой цели бвктеризльная масса получает. ся при использовании предлагаемого способа из 70 л культуральной жидкости, з в случае периодического культивирования или выращи. вания бактерий по прототипу требуется 900 л культурзльной жидкости, Соответственно уменьшается объем работы, связанный с изготовлением шпательной среды и отделением 50бактерий иэ культуральной жидкости при цепь рифугирови сии.