Способ определения антител к н v 1

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ 01 И 33/53, А 61 К 39 ТЕН АТЕН е. Асад. Яс 1986, 83 29783, кл. 530-324 Э/апцет.а. Лгос, Мат6159-6163. Патент США М 461986. ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(56) ЯСЬогг ет а, Н. Епд. Мес 1985 313;385,Лорочс ет аЯсепсе, 1984, 224, 497500.К 0 Ьп е 1 а апсе 1 , 1985, 1222 - 1223.Оао ет аЯсепсе, 1984, 224; 503,Аап е 1 а., Зсепсе, 1985 - 228; 1091 -Изобретение относится к синтетическим пептидным антигенам, последовательности которых соответствуют областям НЗЧ - 1 белков, и к их применению в качестве диагностических реагентов для определения наличия антител к НЗЧ - 1. Петиды также могут быть использованы в качестве иммуногенов в композициях для стимуляции продуцирования антител против Н.Ч - 1,НЛ - 1 (человеческий вирус иммунодефицита) является названием данным группе высоко родственных вирусов, которые были идентифицированы как первичный этиологический агент для синдрома приобретенного иммунодефицита (А 05) у людей(54) СПОС Н)Ч(57) Испостика СПИлага ютссоответст ски реакти при дигно ОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕ ьзование: иммунология, диагноДа. Сущность изобретения; предсинтетические пептиды, вующие областям иммунологичевных белков Н)Ч, используемые стике Н)Ч-инфекции. 7 табл., 3(СПИДа). НЗЧ - 1, который также известен как НТ У - , .АЧ и АКЧ, является главной проблемой мирового здравоохранения, С ОО тех пор как НЧ - 1 был впервые идентифи цирован как этиологический агент СПИДа, а значительный прогресс был достигнут в исследованиях вируса как такового и механизмов, с помощью которых вирус вызывает заболевание, и в разработке диагностических тестов для определения наличия вируса или инфекции,Методы определения заражения вирусом Н 3 Ч - 1 в общем заключается в измерении наличия вируса путем обнаружения и количественного определения антител к НЗЧ - 1 - антигенам в крови, сыворотке и1802871 19 20 Иммунологическая реактивность, определенная Е 1 1 ЯА между Н 1 Чантителами в 233 образцах достоверно положительных сывороток и синтетическими пелтидными антигенами,соответствуюцими областям др 11 Сыворотка, образец "2,500 нологической реакции, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышенияточности, в качестве антигена используютодин или более полипептидов формулы Х-Азрцц-.ец.ецуе-Тгр-Оу-Су з-Зег.61 у.увец-Ие-Суз-ТЬг-ТЬг-А 1 аЧа 1-Рго-Тгр-Авп-У.Й, Азрп-Оп.ец. е ц -6у-Т г ру- Су 3-Зе гу.у з-.е це- Суз-ТЬ г-А 1 а-Ча-Р го-Тг рАзп-Суз-О Н, Х-А 1 а.ец-.уз-Туг-ТгрАзпецецп-Туг- Тгр-Зегп ц.ец.уз-Азп-Зег-Аа-Ча 1-8 ег-У, Х.уз-Азпег-А 1 а-Ча 1-8 ег.ец.ец-Аз и-А 1 а-ТЬ г-,А 1 ае-А а-Ча 1-А ац-О у-ТЬ гАзр-У-Е, Х-ТЬг-Аа-Ча 1-Рго-Тгр-Азп-А 1 а е г - Т г р - 3 е г - А з и - . у зЗег-.ецц-Оц1 е-Тгр-Азп-Азп-Ме 1-ТЬг -Тгр-Мег-У-Е, Х-Ие-Азп-Ту -ТЬг-Зег-.ецИе-Н 1 з-Зегец-Ие- Оцц-Зегц-Авп-Ои- О 1 и -.6 1 ц - Е. у-з - А з и - 0 1 ц - У - Е, Х- Р го-Агд-ТЬ г-Е.е ц-А з и-Аа-Тгр - Ч а 1-1 у в - Ч а 1- Ч а 1- О г ц - 61 ц - 1. у 3- А 1 а- Р Ь ее г- Р гоц-Ча-У-Е, Х- Чацу- уз-А 1 а-РЬе-Зег-Ргоц - Чай 1 е- Рго-Мет-РЬе-Зег-А 1 а.ец-Зег 61 цу-У-Е, Х 01 ц-Мет-Мет-ТЬг-Аа-Суз 01 и -61 у-Ч а 1-61 ууР гоу-Н 1 з-Еуз-Аа-Агд-Ча 1-1.ец-А 1 ац-У-Е, Хегц1 у-Суз-А гдпе-.ец 01 у-Оп-.ецп- Рго-Зег-.ецп-ТЬгуЗегц1 ц-.ец-У,и/илиХец-Туг-Суз-Ча 1-Н 1 з-О и-Агд-Ие ц-Пеуз- Аз р-ТЬг-.узц-А 1 а.ец-Азр 1.уз-Ие-У-Е,где Х- или Н в аминоконцевой.МНУ-группепептида, или аминокислота, связанная саминоконцевой ЙН 2-группой пептида, причем кислота выбрана для обеспечения связывания пептида с белковым носителем;,1- или Суз, или отсутствует,2 - или ОН, или йН 2,П рио ритет по и р из на кам27.03.87 - пептид Азрпп-.ец-.ец 01 уе-Тру-Суз-Зегу.уз-еце-СузТЬг-ТЬг-А 1 а-Ча 1-Рго-Тгр-Азп-Суз-ОН.18.05.87 Все другие признаки формулыизобретения.Таблица 2 1,33 Ь О, 289 1, 70 Ь О, Ц 8 О, ч 8 ч 1,чч 3 0,810 1,399 1,88932 1802871 Продолпение табл.2 итти аее зтиииии е аи и аа ае т т ае т т а т т т и и 1,923 2,831 2,93 1,03 2,621 0,593 2,М 8 520 50 1,107 О, 509 0,825 0,829 1,й 6 2,311 О, 679 О, 530 1,655 1,177 0,38 ч 1, 085 1,852 1, 412 10 1,093 2, 764 0,350 0,905Таблица 3 Е 1.1 ЯА тесты сравнения специФичности и селективности синтетических пептидных антигенов тт ти и и ии а еа ееииеа а Отрицатель" у 0 ный антнген 1 н1802871 Продолжение табл.З о, 048 О, 051 0,063 0,178 0,101 0,086 0,123 0,118 0,252 39513 39514 39515 вав еф ВФ фе Ф МЮСпектрофотометрический показатель, О.ДНе-Н.1 Ч-Х антигенОтклонение = Среднее О.Д. отрицательной сыворотки +1802871 Продолжение табл.4 30 40 50е е ф юОтклонение ; - Среднее О.Д. отрицательной Отклонение АЯ = 0,151 + 3 х 0,053 = 0,310 сыворотки + 3 х БД Отклонение Ч(39) = 0,152 + 3 х 0,050 = 0;302Отклонение АЗ-Тгипс (а) = 0,166 + 3 х 0,033 = 0,265В = блот-анализ ВестернаСпектрофотометрицеский показатель, О.ДОНе-НХЧантиген 277 285 298 324 375 393 416 428 446 457 477 478 517 520 523 524 525 532 536 539 540 39508 39509 39510 39511 39512 39513 39514 39515веществах, вырабатываемых из крови, Та. кие методы используют с целью диагностики АРЗ (СПИДа) и АЙС (А 10 Зродственного комплекса) и для скринингакрови и продуктов из крови на предшествующее воздействие Н 3 Ч - 1.Диагностику НЧ - 1 инфекций и скринирование крови на наличие Н 3 Чобычноосуществляют с помощью методик иммуноферментного анализа (Е ОЗА), чтобы определить наличие антител к иммуногеннымкомпонентам Н 1 Ч - 1 в испытуемом образце.Другие методы включают использование блоттинговых методик Вестерна для Определения НЛЧ - 1 специфических антителв испытуемых образцах. В общем можетбыть применен почти любой известный иммуноанализ, такой как радиоиммуноаналиэ,при использовании специфических реагентов для детектирования.Н 3 Ч - 1 и антител кнему.Источником антигенов в первой генерации этих анализов обычно являлись антигенные белки, полученные из Н,1 Ч - 1,продуцированного линиями человеческиххелперных Т-лимфобластоидных клеток, таких как Нд. Хотя зти первые генерации тестов Е 13 А на НЧ - 1 являлись достаточночувствительными и специфическими, использование этих антигенов, полученных изживых вирусных препаратов, вызываетсерьезные существенные трудности.Продуцирование самого.НЧ - 1 в непрерывных клеточных линиях может бытьосуществлено с высокой степенью (РЗ компонент) в лабораториях из-за опасности дляисследователей подвергнуться вредномувоздействию вируса. Кроме того, имеютсячеткие ложные отрицательные и ложные положительные результаты, которые были.получены в тестах ЕОЗА с использованиемцелых антигенов вируса,Блот-анализ Вестерна с использовани;ем цельных вирусных антигенов обеспечивает более высокую специфичность, но онболее трудоемок и требует больших затратвремени, чем ЕОЗА тесты. Кроме того, таккак Н 9 и другие Н,1 Ч - 1 продуцирующиеклетки являются линиями человеческих клеток, если они не подвергнуты дорогостоящей очистке, они могут загрязнЕныобычными клеточными антигенами, такимикак Н.А антигены, которые могут вызватьложную положительную реакцию в тестеЕОЗА.Дорогостоящая очистка вирусных антигенов из клеточных линий также можетпредположительно разрушать иммуногенность иммунологически важных белков или, другими словами, дезактивировать антигены, в результате чего продуцируются реагенты, которые приводят к ложным отрицательным реакциям, Дополнительно, ложные отрицательные реакции с использованием антигенов, полученных. из интактных вирусных препаратов, могут встречаться из-эа стерических затруднений, из-за которых антитела к вирусным антиге 10 на не могут взаимодействовать со своим специфическим антигеном, потому что реакция заблокирована наличием других вирусных антигенов и антител в реакционной смеси. Во второй генерации тестов ЕОЗА для Как показано на фиг.1, Н.Ч - 1 является относительно сложным ретровирусом. содержащим по крайней мере семь генов. Вирусные структуральные гены, обозначенные дад, ро 3 и епч соответственно, кодируют 30 белки вирусного ядра, обратную транскриптазу и вирусные гликопротеины вирусной обОлочки. Другие гены, показанные на фиг,1, являются вспомогательными генами, включенными в репликацию вируса Гены 35 дад и епч кодируют полипротеины, синтезированные из каждого из этих генов, являются пост-трансляционно расщепляемыми на несколько малых протеинов. Предыдущие исследования показали, что белки, кодированные дад и особенно епч- областями Н.Ч - 1 - генома, являются иммунологически важными, так как антитела к продуктам цад и епч генов найдены в сыворотке А 1 РЗ и АВС пациентов. 40 епч - ген кодирует гликопротеин (ц р 160) с кажущейся молекулярной массой (Мг) около 160 000 дальтон, который является пост синтетически расщепляемым на два гликопротеина, д р 120 и д р 41 с молекулярной массой 120000 и 41 000 соответственно. Гликопротеин др 120 является по-видимому наружным белком вирусной оболочки, тогда как "цр 41 по-видимому является трансмембранным белком, И др 120 и др 41 являются 50 иммуногенными с. антителами к обоим белкам, которые легко определяются в сыворотке больных А 10 З и АВС.Поскольку антитела к др 120 и др 160 в сыворотке больных А 10 З и АВС, а также асимптоматических индивидуумов, зара 55 определения Н 3 Ч - 1 инфекции применяют иммунологически важные вирусные белки,. которые могут быть продуцированы клонирующими участками НЗЧ -1 генома в бакте рии. Вирусный этиологический агент А 10 З(т.е. вирусы, ранее называемые НТОЧ 1, .АЧ и АЯЧ) из различных источников был изолирован, клонирован и была определена нуклеотидная последовательность.1802871 Та блица.5 Реактивность синтетических пептидов, соответствующих областям НХЧ- ар 41, с антителами против НХЧв заведомо положительных сыворотках 10(+) = слабая положитеЛьная реакциьная реакция+ = сильная поаблИммунологическая реактивность пептидных антигент соответствующих НЧ6 АО генному продукту Источник сыворотки1802871Таблица 7Иммунологическая реактивность антител в образцах сывороток от больных НЧи НЧс пептидами,соответствующими НЧи ЙЧгенными продуктами ЯЙЯ .. Юско Заказ 862 ВНИИПИ Гос Тираж Подписноерственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 роизаодстаенно-издатеакскии комбинат "Патент", г. Ужгород, уа Гагарина, 11802871 5 10 20 40 др 160/др 41 преимуществами в отношении продуциро- пр сания специФических антител н реактиано. ни женных вирусом, являются нейтрализующими, т.е, ингибируют связывание вируса, др 120, др 160 или их участки являются кандидатами.для субединицы вакцины. Транс- мембранный гликопротеин др 41 является ЮЧ - 1 антигеном, более последовательно распознаваемым антителами в сыворотке больных А 05 и АВС (5). Кроме того, антитела в сыворотке больного также распознают эпитопы белков ядра вируса, кодируемых дад - геном,Иммунологически важные НЗЧанти- гены для применения в диагностике и как потенциальные композиции вакцины были приготовлены путем клонирования участков НЗЧ - 1 генома в различных экспрессирующие системы, такие как бактерии, дрожжи или чассиа, Н,ЗЧ - 1 антигены, продуциро- ванные по методикам рекомбинантной ДНК, однако, должны еще пройти дорогостоящую очистку, чтобы избежать ложных положительных реакций в Е ЯА из-за реактивности любого антитела к антигенам системы экспрессии, которые могут загрязнять препарат Н.Ч - 1 антигена. Также денатурация ЙЬЧ - 1 антигенов во время очистки может разрушить важную антигенную активность.Белок антигенов содержит ряд эпитопов или антигенных детерминант, которые являются областями в белках, которые содержат сайты связывания для специфических антител. В общем белковые антигены срдержат 5-10 эпитопов, каждый из которых содержит последовательность из 6 - 8 аминокислот. Эпитопы могут быть или непрерывными, в которых 6-8 аминокислот имеются в последовательности, или периодическими, в которых аминокислоты, которые образуют эпитоп, связаны вместе трехмерной укладкой белков. Хотя эпитоп состоиттолько из относительно небольшого числа аминокислот, их реактивность с анти- телом находится под влиянием аминокислот в белке, который окружают эпитоп,Исследования, направленные на картирование антигенных сайтов или эпитопов белков, были выполнены с использованием синтетических пептидов, соответствующих различным областям интересующих белков,Помимо их полезности в исследованиях для картирования эпитопов синтетические пептиды, если они охватывают основные антигенные детерминанты белка, обладают потенциалом в качестве вакцин и диагностических агентов. Синтетические пептидные антигены обладают некоторыми сти, Последовательность синтезированного пентида может быть выбрана среди аминокислотных последовательностей, которые фактически определены при аминокислотном секвенсировании белка, или выводятся из последовательности ДНК, кодирующей белок. Использование специфических синтетических пептидов устраняет необходимость в использовании белка полной длины при продуцировании или для анализа специфических антител. Кроме того, методика синтеза пептидов в твердой фазе позволяет получать химически практически неограниценные количества интересующего пептида. Доступность автоматизированных синтезаторов пептидов является дополнительным преимуществом таких методик.В некоторых публикациях представлены данные, показывающие иммунологическую реактивность выбранных синтетических пептидов, соответствующих антигенным белкам НЗЧ. В одном исследовании был синтезирован пептид, имеющий аминокислотную последовательность Туг-Азр-Агд-Р гоооу- е оо 6 у о-Агд-Азр-Агр-Аз р-Агд-Бегу-Суз, которая соответствует аминокислотым остаткам 735 - 752 УЬЧ - 1. Этот пептид, который является частью др 41, использовали 30 для иммунизации кроликов в попытке вызвать нейтрализующий антитела ответ вНЧ - 1,Кроме того, несколько сывороток отбольных А 05, про которых было известно,35 что они содержат анти-др 41 антитела, были мало реактивными с этим пептидом; это указывает, что этот пептид содержит по крайней мере один эпитоп, распознаваемый до некоторой степени антителами к нативному Недавно вышедшая работа относится к обеспечению синтетических пептидов для диагностики А 03 в дополнение к разработке композиций вакцины. В одном исследовании был синтезирован пептид.из 21 аминокислоты, названный ЗМ 284, с аминокислотной последовательностью Агд-Ие ео-Аа-Чао-Агд-Тугео- уз-Азро- ео- еоу-Иеу-Суз-Бег,Этот пептидкоторый соответствует аминокислотам 586 - 606 в др 160 и содержит антигеннь 1 й сегмент др 41, является реактивным с Н,Ч - 1 положительной сывороткой от больных А 03/АВС при анализе методами Е ЯА и блоттиг-анализе Вестерна. ЯМ 284 пептид благоприятно выдерживает сравнение с протеинами,оисходящим из НЗЧ, при детектироваи НЗЧ - 1 антител по методу ЕОЯА.нований 7516-7593 Н 1 Ч - 1 генома. Пептид Ч (39) реагирует с 23/24 (95,8 фб) образцами сыворотки от больных с достоверной НЗЧ - 1 инфекцией.Б соответствии с настоящим изобретением предлагаются новые синтетические пептиды, соответствующие антигенным Н.Ч - 1 белкам, которые являются полезными и превышают по селективности диагно; стические методы для детектирования Н 1 Ч - 1 инфекций.Найдены новые синтетические пептидные антигены, соответствующие гликопротеину цр 41, кодированному НЗЧ - 1 епч геном.Эти пептиды используются для диагностики АОЯ у подозрительных индивидуу 50 мов и в методах для скрининга на воздействие НЗЧ - 1 крови и происходящихиз крови продуктов с высокой степенью надежности и очень незначительным количеством ложных результатов.Пептиды могут быть использованы в методах определения антител к НЗЧ - 1 в обрээцэх. Методы включают контактирование 40 45. Например, в методе Е ЯЛ с использо, ванием ЯМ 284 детектируют антитела в образцах сыворотки у 96,5; больных А 1 ОЯАВС и 34,6 здоровых асимптоматических с высоким риском индивидуумов. Не 5 имелось ложных положительных в 387 сыворотках от контрольных индивидуумов.Серологический и химический анализы ЯМ 284 пептида и родственных пептидов показали, что некоторые аминокислоты по-ви димому являются более важными, чем другие при взаимодействии энтителоантиген пептида.. Делеция остатков Агу, Ие- и 1 узиэ пептида значительно снижает или унич . тожает серологическую реактивность. Делеция ТГУу-Суз-Яег остатков у карбоксильного конца. пептида, с другой .стороны, приводит в результате к умеренной потере серологической активности, ука зывая,. что аминоконцевая часть пептида является по-видимому более важной, чем карбоксильная концевая часть для иммунологической реактивности.Предлагается несколько иммунологиче ски реактивных синтетических пептидов, соответствующих областям Н,1 Ч - 1 белков ,для детектирования А 10 Я и А 1 ОЯ - родственной болезни. Особенно интересным является пептид Ч . (39), . имеющий 30 последовательность Агд-Ие.ец-А 1 а-.Ча 1-61 оАгд-Тугеоуз-Азроо.ео- еоу-И е-Тгру-Суз-Яегу.уз- ео-Ие-Суз Х, где Х является ОН или ИН 2, который соответствует участку 9 р 41, кодируемому парами ос образца с пептидными антигенами в условиях, которые позволяют образоваться иммунологичесокму комплексу между пептидом и любым Н,1 Чспецифическим антителом в образце. Измерение образования комплекса с помощью любого детектирующего средства указывает на наличие или отсутствие антител к НЗЧ. - 1 в образце.Также могут быть использованы новые пептиды в качестве иммуногенов в композициях вакцины для иммунизации против НЯ - 1 инфекции или для продуцировэния у животных Н,)Ч - 1 специфических антител против Н,)Ч - 1 антигенов.На фиг.1 схематически представлены гены Н.Ч - 1, на фиг.2 - ген 9 р 41 НЗЧ, изображенный в виде частично перекрывающих пептидов, синтезированных в соответствии с изобретением, и сравнение известных пептидов, соответствующих цр 41, на фиг.3 - гистограмма, показывающая величины Е 1 ЯА, полученные с использованием 9 Р 4 А 5 в качестве антигенэ.Изобретение посвящено ряду пептидов длиной 15 - 27 аминокислот, соответствующих областям белкового продукта целого НЗЧ - 1 оао гена и др 41 НЗЧ - 1, которые были синтезированы и испытаны на иммунореактивность к НЗЧ - 1 положительным образцам сыворотки, полученным из Соединенных Штатов, Великобритании, Израиля, Африки и Швеции. Новые пептиды являются полезными в тестах на диагностику Н 1 Ч - 1 инфекции или на предшествующее воздействие вируса и в качестве иммуногенов в композициях, чтобы вызвать продуцирование у животных и людей антител против Н, Ч, Пептиды, соответствующие дар белкам и в частности цр 41 были собраны и синтезированы, потому что эти Н 3 Ч - 1 белки показывают меньшую вариацию от штам- ма к штамму характеристик, чем другие иммунологически важные НЯ - 1 антигенные белки, такие как цр 120, Пептиды, охватывэемые изобретением, включают олигопептиды, имеющие аминокислотные последовательности, содержащие такие последовательности, которые содержат непрерывные (линейные) эпитопы, реактивные с Н 1 Ч - 1 специфическими антител ами,Следовательно, изобретение охватывает группу иммунологически реактивных пептидов и функционально эквивалентных вариантов их, которые не ухудшают в значительной мере антигенные свойства пептида, соответствующего др 41, кодируемого епч геном НЗЧ - 1.Области др 41, соответствующие каждому пептиду, детально описанному ниже, показаны на фиг.2, Все пептиды синтезирован ы по известным методикам синтеза пептидов на твердой фазе. Синтез также позволяет, чтобы одна или две аминокислоты, несоответствующие первоначальной последовательности белка, были добавлены к ИН 2 - или СООН - концу пептидов. Такие наружные аминокислоты являются полезными для сочетания пептидов друг с другом, для содержания с белковым носителем или с подложкой. Аминокислоты, которые являются полезными для этих целей, включают тирозин, лизин, глютаминовую кислоту, аспаргиновую кислоту, цистеин и их производные, Могут быть использованы дополнительные методики модификации белков, например, КН 2 - ацетилирование или СООН - концевое амидирование, чтобы обеспечить дополнительное средство для сочетания пептидов с другим белком или молекулой пептида или подложкой,Новые пептиды, соответствующие др 41, представлены ниже:9 р 41 А 5Х-Азрппецецу-Пе-ТгруСуз-Яегуузеце-Суз-ТЬг-ТЬг-А 1 а-Ча 1 -Рго-Тгр-Азп+Е, где Х является или Н концевой амино ИН 2 - группы пептида, или дополнительной аминокислотойсвязанной с аминоконцевой КН 2 - группой пептида, дополнительную аминокислоту выбирают для облегчения сочетания пептида с носителем белка; 3 - отсутствует или является Суз; а.Е является ОН или ИН 2.Пептид др 41 А 5, который соответствует аминокислотам 596 - 618, кодируемым парами оснований (по) 7563 по 7632 Н 3 Ч - 1 генома, соответствующими епч гену является особенно предпочтительным вариантом настоящего изобретения. Пептид др 41 А 5 в котором Х является Н 2, 3 является Суз и 2 является ОН, является особенно предпочтительным.др 41 СТ 4Пептид др 41 СТ 4, который соответствует области др 41 белка, кодируемого по примерно от 8173 до 8238 НЗЧгенома, имеет формулу: Х-А 1 а.ец.уз-Туг-Тгр-Тгр-Азп.ецецц-Туг-Тгр-Яегпц.ец.уз-А зп-Яег-А 1 а-Ча 1-Яег-Я, где Х,и Е имеют указанные ранее значения.др 41 СТЗПептид др 41 СТЗМ, который соответствует области дР 41, кодируемой по от примерно 8220 до 8280 НЗЧ - 1, имеет формулу: Хуз-Азп-Яег-Аа-Ча 1-Яегец.ец-Азп-Аа -ТЬ г-Аэ-Пе-А 1 а-Ча 1-Аа-О цу-ТЬг-Аз р-,3-2 где Х, 3 и Е имеют указанные ранее значения,др 4181Пептид 9 р 41 В 1, который сьответствует области др 41, кодируемой от пр.,мерно по 7614 до 7686 1-1,3 Ч - 1 генома епч гена, имеет формулу: Х-ТЬг-Аа-Ча 1-Рго-Тгр-Азо-А 1 а-ЯегТгр-Яег-Азпуз-Яегеццц- е-Тгр-Аз п-Азп-Мет-Тгр-Тгр-Мет-З-Е, где Х, 3 и Е имеют указанные ранее значения,др 41 ВЗПептид др 4183, который соответствует области дР 41, кодируемой примерно по 7705 до 7773 Н.1 Ч - 1 генома, имеет формулу: Х-е-Азп-Туг-ТЬг-Яегец-Пе-Н 1 з-Яеец-И ецц-Яегп-Азпии-О иуз-Азп -61 ц-З-Е, где Х,.1 и 2 имеют указанные ранее значения. Кроме того, изобретение охватывает некоторые иммунологически реактивные пептиды и их функциональные варианты, соответствующие областям белковых продуктов, кодируемых дад геном Н 1 Ч - 1(фиг.1). Эти новые пептиды представленыниже: ОАО 2 Пептид ОАО 2, который соответствует 25 области дад генного продукта, кодируемого по примерно 779 до 840 дад гена Н 1 Ч - 1, имеет формулу: Х-Рго-Агд-ТЬец-Азп-А 1 аТгр-Ча 1-Ча 1-81 ццуз-А 1 а-РЬе-Яег-Ргоц -Ча 1-,3-7, где Х,и Е имеют указанные ранее 30 значения ОАО 3 Пептид ОАО 3, который соответствуетобласти дад генного белкового продукта, кодируемого по примерно 810 до 870 дад гена,35 имеет формулу: Х-Ча 1-81 ццуз-А а-РЬеЯег-Ргоц-Ча 1-11 е- Рго-Мет.-Р Ье-Яег-А 1 а 1 ец-Яегцу-2, где Х, 3 и 2 имеют указанные ранее значения, ОАО 14 40 Пептид ОАО 14, который соответствуетобласти дад генного продукта, кодируемого по примерно 1368 до 1430 НЗЧ - 1 дад гена,имеет формулу: Х-О ц-Мет-Мес-Тйг-Аа-Суз 6 и-Оу-Ча 1-Оуу-Рго-Оу-Н 1 зуз-А 1 а-Агд Р 17-0Пептид Р 17-0, который соответствует области дад генного белкового продукта, кодируемой по примерно 495 до 560 НЗЧ - 1 оао гена, имеет формулу: У-Яегцу-СузАгдпе.ецупецп-Рго-Яег.ец -61 п-ТЬгу-Яегп-Еец-Я где Х,3 и Еимеют указанные ранее значения.Р 17-ГПеприд Р 17-Г, который соответствует 55 области оао генного белкового продукта, кодируемой по примерно 588 до 647 Н,1 Ч - 1оао гена, имеет формулу: Хец-Туг-Суз-Ча 1 Н 1 зп-Агд еп-Иеуз-Азп-ТЬ.-1 уз-Оц 45 -Ча.ец-Аа-О ц-,3-Е, где Х, 3 и Е имеют указанные ранее значения.-А 1 а.ец-Азруэе-З-Е, где Х, 3 и Е имеют указанные ранее значения.Пептиды могут быть использованы в способах детектирования антител к НЮ - 1 или ассоциированным НЗч - 1 антигенам. Предпочтительно методы, которые используют пептиды для детектирования наличия НЗЧ - 1 специфических антител в образце, включают контактирование образца с по крайней мере, одним из пептидов в условиях, которые допускают образование имму-. нологического комплекса между пептидным антигеном и любыми антителами к НЯ - 1, которые могут присутствовать в образце. Образование иммунологического комплекса, если оно происходит, указывает на наличие антител к Н.1 Ч - 1 в образце, затем оно детектируется и измеряется подходящими средствами.Такие методы включают, среди прочих, иммуноанализ гемогенного и гетерогенного связывания, такой как радиоиммуноанализ (РИА), Е 1 1 ЯА, и блот-анализ Вестерна. Кроме того, протоколы анализов с использованием новых пептидов позволяют провести исследование конкурентного и неконкурентного связывания,Пептиды могут быть мечеными (ненерирующими сигнал) или немеченными в зависимости от типа используемого анализа. Метки, которые могут быть соединены с пептидом, хорошо известны на данном уровне техники и включают, среди прочих, ферменты, радионуклиды, флюорогенные и хромогенные субстраты, кофаткоры, биотин/авидин, коллоидное золото и магнитные частицы. Модификация новых пептидов позволяет сочетать их известными методами с носителями белков или пептидов или с известными подложками. например, полистирольными или поливинилхлоридными плашками для микротирования, стеклянными трубками или стеклянными шариками и хроматографическими носителями, таким как бумага, целлюлоза и производные целлюлозы, и оксид кремния,Предпочтительной аналитической методикой, особенно для широко масштабного клинического скрининга сыворотки и крови и происходящих иэ крови продуктов больных являются Е 113 А и блот-аналиэ Вестерна, особенно предпочтительной является методика Е 11 ЯА, Е 113 А тесты, применяющие описанные выше пептиды, основаны обычно на тестах с использованием НЗЧ - 1 белков или их частей, происходящих из человеческих клеток или полученных по методике рекомбинатной ДНК, в качестве антигенов При использовании в качестве реагентов е этих анализах пептиды обычно связывают с внешней поверхностью стенокмикротитратора. Пептиды могут быть непосредственно связаны со стенкой микротитратора. Однако было обнаружено, что5 максимальное связывание пептидов состенками может быть осуществлено припредварительной обработке стенок полилизином перед добавлением пептидов,Дополнительно новые пептиды могут10 быть ковалентно присоединены с помощьюизвестных средств к белковому носителю,такому как БСА, полученный в результатеконъюгат используют для покрытия стенок,Обычно пептиды используют в концентра 15 ции между 10 и 100 мкг/мл для покрытия,хотя некоторые пептиды для успешного анализа имеют концентрации порядка 500мкг/мл.Образцы затем наносят на покрытые20 пептидом стенки, где образуется иммунологический комплекс, если в образце имеютсяантитела к НЗЧ - 1, Могут быть добавленыгенерирующие сигнал средства, чтобы способствовать определению образования25 комплекса. Детектируемый сигнал продуцируется. если в образце имеются специфические к НЗЧ - 1 антитела.Изобретение далее иллюстрируетсяследующими конкретными примерами, ко 30 торце ни в коей мере не должны рассматриваться как ограничивающие областьизббретения.П р и м е р 1; Для синтеза всех пептидовиспользуют Эпплайд Биосистем пептидсин 35 тезизер Модель 430 А, В каждом синтезеиспользуют и-метилбензилгидриламиннуютвердую фазу - подложку из смолы "Пептидс Интернейшнл ЛуисвиллЬ, КИ). Пептиды были синтезированы в соотвествии с40 Инструкцией для пользователя для ПептидСинтеэизер Модель 430 А, Эпплайд биосистемс, 1986 г,Все аминокислоты для использования всинтезе, содержащие трет.-бутилкарбо 45 нильную группу (т-Вос), защищающую а -ИН 2- группу, были получены из НовабиохемАГ, Швейцария, Аминокислоты с реактивными боковыми группами, содержат дополнительные защищающие группы для50 предотвращения нежелательных и вредныхреакций в боковых цепях.Индивидуальные защищенные аминокислоты, использованные для синтезе всехпептидов, приведены в таблице 1, находя 55 щейся в приложении,После завершения конкретного синтезаудаляют защищающие группы их синтезированного пептида и пептид отщепляют отсмолы твердого носителя с помощью обработки безводной фтористоводородной кислатой (НГ) при 0 С в сочетании с 10% анизола и 10% диметилсульфоксида в качестве очищающих агентов. Затем прибавляют 2 , Тиокрезола для цистеин-содержащих пептидов, отдувают током азота НР из образца, 5 удаление любого остаточного УР осуществляют путем вакуумирования образца при 0 С, Пептиды экстрагируют из смолы при обработке трифторуксусной кислотой (ТФУК), которую затем удаляют выпарива нием при комнатной температуре, После удаления ТФУК пептиды осаждают и промывают.безводным эфиром.Таблица 1 15Аминокислоты, использованные длясинтеза пептидовВос-А а-ОНВас-Агд(Тоз)-ОН5 Вос-Лзп-ОНВас-Азр-(О Вг 1)-ОНВос-СузрМеОВг 1)-0Васц(0 Вг 1)-ОНВоси-ОН10 Васу-О Н 25Вос-Н з(Тоз)-ОНВос-Ие-ОН 1/2 Н 20Вос- еа-ОН Н 20Вос- уз(2-С 1-7)-ОН (сгуз 1.)15 Вос-Мет-ОН 30Вос-Р 1 е-О НВос-Рго-ОНВос-ЯегВг 1)-ОН О СНАВас-ТЬВг 1)-ОН20 Вас-Тгр(Еоггпу 1)-ОН 35Вас-Туг(2-В г-г)-ОНВос-Ча-ОНТаз = тоэил или и-толуолсульфоновая кислотаоВг = бензилокси .. рМеоВг = и-метилбензилокси 402-С 1-г = карбобензоксихлорид2-Вг-г= карбабензоксибромидПеред использованием в конкретноманализе пептиды могут быть дополнительно 45очищены, при желании, с помощью высоко,эффективной жидкостной хроматографии собратимой фазой (НР.С). Особенно пригодной колонкой для такой очистки являетсяколонка с обратимой фазой Видек С, 50для элюирования пептидов используют гра-диент вода (ТФУК) - ацетонитрил (ТФУК),П р и м е р 2. Синтезируют пептиддр 41 А 5, имеющий аминокислотную последовательность Азппп.еа.еау-ИеТгру-Суз-Зегу.узец-Ие-Суз-ТЬг-ТЬ.-Аа-Ча 1-Рго-Тгр-Ахп-Суз-ОН, по методикепримера 1 и используют его в Е.13 А дляизмерения его иммунологической реактивности,На плашки для микротитрования наносят палилизин в концентрации 1 мг/мл и инкубируют 30 мин, Затем полилизин обрасывают и на стенки плашки наносят пептид др 41 А 5 в концентрации от 10 до 100 мкг/мл для покрытия. После инкубирования пептида на стенках в течение периода времени, достаточного для связывания со стенкой, удаляют раствор пептида и прибавляют в течение 15 минут раствор глутаравого альдегида, который стабилизирует присоединение пептида к стенкам. Затем удаляют раствор глутарового альдегида, стенки промывают буфером и прибавляют смесь глицина и бычьего сываратачного альбумина БСА), который служитдля блокирования несвязанных сайтов на стенках и сводит к минимуму нееспецифическое связывание антител во время самого теста Е 1 ЗА. После стадии окончательной промывки плашки готовы к использованию. Покрытые пептидом плашки для микратитрования могут храниться несколько месяцев без какого-либо снижения антигенной активности пептида др 41 А 5, покрывающего стенки,Используют обычный вариант известныхметодов Е 115 А с плашками для микротитравания, приготовленными, как описано выше, Образцы сыворотки от индивидуумов; которые были разбавлены 1:50 в РВ 5 (фосфатный буферный солевой раствор), содержащем 0,05% полиоксиэтиленсорбитан монолаурата Твин 20), прибавляют 10/ БСА на каждую стенку и инкубируют 30 мин при 37 С во влажной атмосфере. Разбавленные образцы сыворотки затем удаляот из плашек и три раза промывают стенки РВИ, содержащим 0,05;4 Твин 20, Затем прибавляют конъюгираваннае анти-человеческий 1 д антитело на стенки и инкубируют 30 мин. Конъюгированные антитела были получены у коз или кроликов, они являются специфическими для человеческого 1 д С, 1 дМ, легких иммуноглобулинавых цепей и их сочетаний, Предпочтительно в Е 1 ЗА используют коньюгированную щелочную фосфотазу с анти-человеческим 1 дС (от Дакопаттс); разбавленную 1:500 для использования в РВЯ, содержащем 0,050/, Твин 20 и 1 БСА, Затем коньюгат инкубируют в течение достаточного периода времени, чтобы прошла реакция со связанными человеческими антителами, плашки три раза промывают, как указано выше. Для того, чтобы детектировать антитела к НЗЧ - 1 в человеческой сыворотке, которая реагирует с пептидом др 41 А 5, использованным в каче- стае антигена (т.е. положительная реакция), прибавляют храмогенный субстрат субстрата щелочной фосфатазы Сигма, кат, В 104,таблетки), растворяют в натрийкарбонат. ном (МдО буфере и доводят концентрацию до 1 мкл/мл, которая расщепляется ферментом, воздействующим на античеловеческий 1 д с получением окрашенного продукта. После инкубации примерно в течение 40 мин при комнатной температуре положительные реакции указывают на наличие антител в образце, реактивных к антигену, Желтую до оранжевой до красно-коричневой окраску на каждой стенке, указывающую на положительную реакцию, регистрируют на спектрофотометре при 405 нм для количественного определения реакции. Спектрофотометрические показатели регулируют для корректировки основных реакций.На фиг.З представлена гистограмма, показывающая количества антител, полученные иэ четырех отдельных Е 1.1 ЗА определений с использованием р 41 А 5 в качестве антигена, 101 истинной положительная (по блот-анализу Вестерна) сыворотка от больных А 1 РЗ и АВС и 179 истинно отрицательных сывороток вводят в реакцию в системе Е 1 1 ЗА с др 41 А 5; Среднее отклонение для положительных реакций было определено равным О.Д.405 - 0,376. На фиг.З показано, что др 41 А 5 дает положительную реакцию со 100% (101/101) истинно положительных сывороток и 00 (О/179) с истинно отрицательными сыворотками,П р и м е р 3. Для сравнения с новыми пептидами был синтезирован известный пептид Ч (39) Козандэ, как описано в.примере 1, в соответствии с его аминокислотной последовательностью, опйсанной в патенте США М 4629783. Относительная локализация этого пептида в др 41 показана на фиг.2, на котором приведена относительная лока. лизация последовательности др 41 А 5 и других пептидов, соответствующих др 41 Н.1 Ч - 1. Козанд сообщил, что пептид Ч (39) реагирует с 23/24 (95,8) достоверно положительными сыворотками (т,е. при одной ложной отрицательной реакции). Пептид был использован в Е 1.1 ЗА, описанной в примере 2, с заменой на пептид Ч (39) пептида др 41 А 5,Пептид (Ч) (39) дает 221/233 (94,8) положительных реакций с известными Н 1 Чположительными образцами сыворотки, Было отмечено 12 ложных отрицательных реакций, как показано в таблице 2. Кроме того, пептид Ч (39) дал ложную положительную реакцию в одной из 102 (0,98%) достоверно отрицательных сывороток. Образцы сывороток были удостоверены как положительные и отрицательные с помощью блотанализа Вестерна с НЗЧ - 1 белками. Все ложные положительные и отрицательныереакции были подвергнуты блот-анализом Вестерна. Кроме того из фиг,2 видно, что др 41 А 5 имеет частичное перекрывание в аминокислотной последовательности с пептидом ЗМ 284 и пептидом (39) Козанда, Следовательно пептид др 41 А 5 содержит аминокислотную последовательность у карбоксил-концевого участка двух известных пептидов плюс до 10 полнительную последовательность, соотных реакций. Среднее отклонение величин для положительной реакции в тестах Е 1 1 ЗА составило О.Д,405 примерно 0,3, Любое значение ниже 0,3 рассматривается как отрицательная реакция. Легко видеть, что об 40 рэзцы сывороток ММ 7, 19, 40, 44, 60, 101,482, 511, 324, 375 и 393 четко показываютотсутствие реактивности с пептидом Ч(39),но высокую реактивность с д Р 41 А 5, Таблицанаходится в приложении. В таблице 3 приведено дополнительное сравнение более высокой иммунологической реактивности др 41 А 5 по сравнению с пептидом Ч (39) Коэанда, Иэ 233 образцов сывороток, представленных в таблице 2, 38 50 были удостоверены как положительные по блат-анализу Вестерна. Эти положительные сыворотки плюс 8 подтвержденных отрицательных образцов сыворотки (по блот-анализу Вестерна) вводят в реакцию с пептидами др 41 А 5 и Ч (39) в параллельных тестах Е 1.1 ЗА с положительными реакциями, имеющими О.Д.405 примерно 0,3,Кроме того, не-Н 1 Ч - 1 антиген (отрицательный антиген) используют в качестве контроля. Легко видеть, что др 41 А 5 не дает 55 ветствующую области 9 Р 41 с карбоксил-концевой стороны пептидов ЗМ 284 и Ч(39), Как обсуждалось ранее, Вонг сссотр, рассматривал карбоксил-койцевой 15 участок пептида ЗМ 284 как иммунологически менее важный при сравнении с аминоконцевым участком пептида р М.284. В противоположность Вонгу с сотрудниками, однако, расширение замен др 41 А 5 к карбок сильному концу дР 41 приводит в результатек пептиду, имеющему отличные антигенные свойства для детектирования А 1 РЗ - специфических антител в человеческой сывороткеЭтот пептид показывает как более 25 высокую степень реактивности, так и болеевысокую специфичность в Е 1.1 ЗА и в блотанализе Вестерна, чем у обоих пептидов Ч (39) и ЗМ 284,Таблица 2 показывает, что др 41 А 5 реа гирует со всеми 233 (100%) достоверно положительными Н,1 Ч - 1 сыворотками. Эти результаты были получены с теми же 233 сыворотками, испытанными против пептида Ч (39), который дали 12 ложных отрицательни ложных отрицательных ни ложных положительных реакций. Следовательно, неожиданно др 41 А 5 дает по методике Е ЯА результаты, которые являются четко на 100 точными. Диагностическая и скринирующая способности в анализах с использованием др 41 А 5 четко выше, чем у обычных используемых в анализе пептидов Ч (39) и ЯМ 284 или любого другого Н,Я - 1 антигена.П р и м е р 4, Пептид. АЯ-Тгоп с/а/ с пропущенным карбоксильным концевым участком др 31 А 5 фиг.2 также синтезируют по методике примера 1 и используют в тестах ЕОЯА, как описано в примере 2, не заменив пептид др 41 А 5 на АЯгцпс/а/, для измерения антигенной активности. Из результатов Е ЯА, представленных в таблицах 4, легко видеть, что очевидно, что карбоксильная концевая часть др 41 А 5 требуется для высокой степени реактивности и специфичности этого пептида,П р и м е р 5, Синтезируют по методике примере 1 пептид др 41 СТ 4, имеющий аминокислотную последовательность, представленную выше, и испытывают в анализе Е ЯА по методике примера 2 (заменив др 41 А 5 на др 41 СТ 4 против 105 Н,Ч - 1 положительных, сывороток (все они реагировали с др 41 А 5). Наносят покрытие на плашки для микротирования по методике примера 2 при концентрации пептида между 10 и 100 мкг/мл, Как показано в таблице 5, этот пептид реагирует с 68/106 (64,8 ) положительными сыворотками. Не наблюдалось ложных положительных реакций при испытании этого пептида против 28 достоверно отрицательных сывороток,П р и м е р 6. Синтезируют по методике примера 1 пептид др 41 СТЗ, имеющий аминокислотную последовательность, представленную выше, и показывают им плашки для микротитрования по методике примера 2 (заменив др 41 А 5 на др 41 СТЗ). Как показано в таблице 5, др 41 СТЗ реагирует с 38/80 (48,8%) образцами заведомо положительных сывороток в анализе Е ЯА, как описано в примерах 2 и 3. Пептид дает только одну ложную положительную реакцию при испытании против 20 заведомо отрицательных сывороток.П р и м е р 7, Покрывают плашки микротитратора пептидом др 41 В 1, синтезированным по методике примера 1, с концентрацией 10-100 мкг/мл, покрытие проводят по поисанной выше методикеи используют в анализе Е.ЯА, как описано в примере 2 (заменив др 41 А 5 на др 41 В 1). Этот пептид реагирует с 45/95 (47,4 6) образцов достоверных Н,Ч - 1 положитель 10 20 25 в таблице 6 30 используют в анализе Е ЯА по методике 40 ответ при использовании Н В - 1 антигенов. 45 50 В 55ных сывороток (таблица 5). Не имелось ложных положительных сывороток (таблица 5), Не имелось ложных положительных реакций с двумя отрицательными сыворотками.П р и м е р 8. Покрывают пептидом др 41 ВЗ, синтезированным по методике примера 1, с концентрацией 10-100 мкг/мл плашки микротитратора, Он дает положительные реакции с 22/32 (68,8 фб) заведомо положительными НЗЧ - 1 образцами сыворотки в анализе Е ЯА, как описано в примерах 2 и 3 (таблица 5). Не наблюдали ложных положительных реакций с двумя заведомо отрицательными сыворотками. П р и м е р 9. Синтезируют ОАО 2 и ОАО 3 и ОАО 14 пептиды по методике примера 1, Наносят покрытие на плашки микротитратора из каждого пептида при концентрации 10-100 мкг/мл и используют в анализе Е ЯА, как описано в примере 2, но изменив др 41 А 5 на ОАО 2, ОАО 3 или ОАО 14 как антиген. Пептид ОАО 2 также анализируют против Н,Ч - 1 положительных образцов сывороток, Результаты анализов приведены П р и м е р 10. Синтезируют пептиды Р 17-О и Р 17-Р по методике примера 1 и покрывают каждый пептидом при концентрации 500 мкг/мл плашки микротитратора,примера 2, но заменив др 41 А 5 на Р 17-О и Р 17-Е в качестве антигена. Эти пептиды также анализируют против Н,Ч - 2 положительных образцов сывороток, Результаты представлены в таблице 7. Н,Ч - 2, родственных ретровирус, но не идентичный Н,Ч - 1, недавно был выделен у больных АОЯ из Западной Африки, который в анализе Е ЯА дает отрицательный Из данных таблиц 6 и 7 можно видеть по данным примеров 9 и 10, что пептиды ОАО 2, Р 17-О и Р 17-Г каждый содержит эпитопы, распознаваемые антителами как к Н.Ч - 1, так и к Н 3 Ч - 2 Следовательно, эти три пептида могут быть полезными для диагностики и композиций вакцин при обеих инфекциях Н,Ч - 1 и НЗЧ - 2.Из приведенных выше результатов очевидно, что новые синтетические пептиды, описанные здесь, которые соответствуют областям иммунологически важных белков НЧ - 1, например др 41 и оао генным продуктам, обеспечивают более чувствительный и селективный анализ на наличие антител к НЧ - 1,Формул а изобретен и я Способ определения антител к Н,Ч - 1 путем взаимодействия с антигеном в имму