Способ консервирования гепатоцитов

(71) Заявит титу лем криобиологии и кри Украинской ССР(54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ГЕПАТОЦИТО м о ацим Изобретение относится к медицине, а именно к способам консервирования клеток, выделенных из тканей.Известен способ консервирования гепатоцитов в питательной среде, со" держащей криопротектор с последующим охлаждением клеток до ультранизких температур по четырехэтапной програ ме, где первый этап-охлаждение клет ной суспензии до точки замерзания, четвертый этап-охлаждение до температуры жидкого азота 13 .Однако замораживание по такой программе приводит к гибели тканевых клеток печени, а именно к снижению скорости .эндогенного дыхания и разобщению процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях гепатоцитов.Цель изобретения - повывение жизнеспособности клеток.Цель дос ти гает с я тем, ч то при осуществлении способа консервирования гепатоцитов в питательной сре" де, содержащей криопротектор с посл дующим охлаждением клеток до ультра"низких температур по четырехэтап" ной программе, при этом на первом этапе охлаждают клеточную суспензию до точки замерзания. и на четвертом этапе - до температуры жидкого азота, клетки печени на втором этапео замораживания охлаждают с 2-4.С до -6 - -8 С со скоростью 20-27 С в мин в течение 0,4-0,6 мин и на третьем этапе с -6 - -8 С до -30 - -35 С соОскоростью 2-4 С в мин в течение 6-12 мин.Способ осуществляется следу образом.Выделенные из печени изолированые клетки суспендируют в среде, содержащей 250 мМ сахарозы,мМ хлористого калия (КС 1), 0,4 мМ фосфата калия однозамещенного (КНР(ф, 0,4 мМ фосфата натрия двухзамещенно" го (ИаНРО), 2 мМ дитиотреитола, 2 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА)90269 0,3 мМ хлооистого магния (М 9 С 1),14 альбумина, рН среды - 7,4.Клетки печени инкубируют с 104154 диметилсул ьфоксидом приготовленным на среде суспендирования, при+2-+4 С в течение 10-15 мин. Консервируют гепатоциты по следующей программе: на первом этапе - охлаждениеклеток от +20-:22 С до +2-;+4 С навтором - охлаждение от +2-.+4 С до 16-6-;-8 С со скоростью 20-27 С в минв течение 04-06 мин, на третьем этапе от -68 С до -3035 С со скоросотью -2-4 в мин в течение 6-12 мини на четвертом этапе - со скоростью 15300-400 С в мин до температурыжидкого азота (-196 С) .П р и м е р 1. Из печени беспо"родных белых крыс-самцов весом 200250 гр выделяли изолированные клетки, Количество изолированных клетокпечени подсчитывали в камере Горяева,Из печени весом 4-5 грамм выходгепатоцитов составлял (190-250) х 10.6На 1 млн изолированных клеток пече" 25ни приходилось 1,0-1,4 мг белка.Гепатоциты суспендировали в среде,содержащей 250 мМ сахарозы, 5 мМ хлористого калия (КС 1) 0,4 мМ фосфатакалия одноэамещенного (КН РО),)ЭО0,4 мМ фосфата натрия двуэамещенного(МаНР, 2 мМ дитиотреитола, 2 мМэтилендиами нт етраац ет ат а (ЭДТА),0,8 мМ хлористого магния (М 9 С 1)13 альбумина, рН,4, Клетки печениинкубировали с 103, диметилсульфокси"дом, приготовленном на среде суспен"дирования, при +2 С в течение 10 мин,Консервировали гепатоциты в полиэтиленовых ампулах по следукщей програм- оме: охлаждение клеток от температу"ры +20 С до +2 ОС, на втором этапе "охлаждение от +2 С до -УГ со скоростью 25 в мин в течение 0,5 мин, натретьем этапе от -б С до -30 С соскоростью 4 о в мин в течение 6 мини на четвертом этапе - со скоростью300"400 в ю)н до температуры жидко"го азота (-196 С) . Отогревали пробына водяной бане при +41 С, Скоростьпотребления кислорода определялиполярографически при 30 С с помощьюбзакрытого платинового электрода типа Кларка. Исследования показали,что в изолированных гепатоцитахдыхание колебалось в пределах 3,55 44,5 Нмолей 0мин. мг белка. Инкубационная смесь объемом 0,5 содержала среду суспендирования со следующими добавками: клеткимг белка,2,4-динитрофенол - 10 М секцинат10 )1. Добавленный в систему в концентф 6рации 10 М динитрофенол оказывалстимулирующее действие на скоростьдыхания. При этом она увеличиваласьв 1,6-1 раза, Сукцинат в концентрации 10 М стимулировал эндогенноедыхание в 3,8-4,0 раза., При добавлении динитрофенола - ф" = 2 0 Чсир,2,2 где Чдн) - скорость дыхания придобавлении разобщителя - динитрофенола (1 ФМ) 1 Ч- скорость дыхания при добавлейии субстрата - сукцината (10 М) .Приведенные данные свидетельствуют о том, что в изолированныхгепатоцитах процессы окисления оопряжены с Фосфорилированием.Исследования показали, что ско"рость эндогенного дыхания составляет 2,6-3,4 Нмоля О мин мгбелка(70-801 от контрольного уровня), асопряженность механизма окисленияи Фосфорилирования в митохондрияхклеток сохраняется 454. Конс ер ви рованные гепатоциты можно хранить в жид.ком азоте на протяжении 3-5 лет, чтопозволяет создать запасы биологически полноценных клеток.Формула изобретенияСпособ консервирования гепатоцитов в питательной среде, содержащейкриопротектор с последующим охлаждением клеток до ультранизких температур по четырехэтапной программе,при этом на первом этапе охлаждаютклеточную суспензию до точки за"мерэания и на четвертом этапе " до)температуры жидкого азота, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения жизнеспособности клеток,клетки печени на втором этапеозамораживания охлаждают с 2-4 С до- -35 С со скоростью 2"4 в минФв течение 6-12 мин.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Патент США Ю 3303632кл. 62-62, 1968.