Способ получения митогенного фактора

1 и 1 84399 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик) Приорит сударственныи комитет 53) УДК 615.771.7(088.8) Бюллетеньло делам изобретений н открытий(43) Опубликовано 07.0 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕН Изобретение относится к медицине, аименно к получению препаратов, стимулиРующих иммунитет,Известен способ получения митогенногофактора путем инкубации культуры лимфоцитов человека с фитогемагглютининомс последующим отмыванием и культивированием лимфоцитов в питательной среде 10Однако этот способ не обеспечивает высокой активности целевого продукта.Цель изобретения - повышение активности целевого продукта.Эта цель достигается тем, что лимфоциты перед инкубацией облучают рентгеновскими лучами в дозе 800 - 1600 Р,Способ осуществляют следующим образом.Лимфоциты выделяют из гепаринизированной крови здоровых доноров в градиенте плотности фиколл-гипаг, отмывают и ресуспендируют в концентрации 3 - 5 млн/млв бессывороточной среде 199, Клеточнуюсуспензию помсщают в чашки Петри и облучают рентгеновскими лучами в дозе800 в 16 Р. Облученные клетки инкубируют с фитогемагглютинином 40 мин при37 С. После инкубации клетки отмываютцентрифугированием и культивируют 72 чпри ЗTС в бессывороточной среде 199,10 15 20 30 ТОГЕННОГО ФАКТОРА После культивирования клетки удаляют из среды путем центрифугирования, а культуральную среду, содержащую митогенный фактор, стерилизуют фильтрацией через миллипоровые фильтры.П р и м е р, Лимфоциты выделяют из свежей донорской крови, стабилизированной гепарином, с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-гипаг (плотность 1,077 г/мл), дважды отмывают средой 199 и ресуспендируют в концентрации 4 млн/мл в бессывороточной среде 199. Клеточную суспензию помещают в чашки Петри, покрытые пластмассовыми крышками, и облучают рентгеновскими лучами на установке РУМ, используя медный фильтр 0,5 мм в режиме облучения 40 Р/мин. При этом клетки облучают увеличивающимися дозами рентгеновских лучей, Р: 400, 800, 1600, 2400. После облучения клетки отмывают средой 199, ресуспендируют в концентрации 3 млн в милли- литре и инкубируют 40 мин при 37 С с фитогемагглютинином-Р в концентрации 3 млн/мл в бессывороточной среде 199, содержащей пенициллин 100 ЕД/мл, стрептомицин 100 ЕД/мл, глютамин 100 мкг/мл, и культивируют 72 ч при 37 С, Газовая среда над культурой состоит из 5% С 02 в воздухе. В конце культивирования клетки удаля843991 кроличьей аптисыворотки против фитогемагглютинина.Синтез ДНК в тсст-культурах исследуютпо включению Н-тимидина, а радиоактив ность клеток измеряют на спектрометре.Активность митогенного фактора выражают индексом стимуляции, который представляет собой отношение синтеза ДНК в тест-культурах с митогенным фактором к 1 О синтезу ДНК в тест-культурах без митогенного фактора, но содержащих 5% анти- сыворотки против фитогемагглютинина и фитогемагглютинин в концентрации 10 мкг/мл (контроль на нейтрализациюфи тогемагглютинина) .Таким образом, индекс стимуляции (ИС)равняется синтез ДНК зН имп/мин в тест-культурахс митогенным фактором синтез ДНК. зН имп/мин в тест-культурахбез митогенного фактора Для получения сравнительных данных параллельно проводят получение митогенного фактора в культурах тех же лимфоид ных клеток по известному способу, котоПредлагаемый способ, доза облучения, Р Известный способ 1600 2400 800 400 12,28 0,31 7,950,62 3,870,17 4,23 0,99 9,25 0,25 П р и м е ч а н и я, 1, Приведены средние арифметические и стандартные ошибки средних 2. Число определений показателя везде 4. Как видно из таблицы облучение клеток в режиме 800 и 1 б 00 Р приводит к увеличению активности фактора в 2 - 3 раза по сравнению с активностью фактора, полу ченного известным способом.Получение высокоактивного фактора позволяет уменьшить затраты крови, идущей для получения фактора,30Формула изобретенияСпособ получения митогенного фактора путем инку бации культуры лимфоцитов Составитель С. МалютинаРедактор М, Стрельникова Техрсд И. Заболотнова Корректо 1)ы: О, Силуянова и Е, ХмелеваЗаказ 1557/13 Изд,424 Тираж 694 Подписное НПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Типография, ир. Сапунова, 2 ют из среды центр ифугирова кием при 1000 об/мин, культуральную среду фильтруют через стерплизующис мпл, ичоро фильтры (размер пор 0,3 мкм). Митогенную активность культуральных сред исследуют в тест-культурах свежих лимфоцитов. Лимфоциты тест-культур культивируют в исследуемой на активность среде, смешанной с равным объемом свежей питательной среды 199 и 10% термоинактивированной человеческой сыворотки, в присутствии антибиотиков и глютамина в указанной концентрации. Для инактивации остатков фитогемагглютинина, содержащихся в исследуемых культуральных средах, в тест-культуры прибавляют 5% рый не включает облучения клеток перед инкубацией.В таблице приводится активность полученного митогенного фактора. человека с фитогемагглютинином с последующим отмыванием и культивированием лпмйоцитов в пи;ательной среде, отлич аю щ и Й си тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, лимфоциты перед инкубацией облучают рентгеновскими луч азги в дозе 800 - 1 б 00 Р,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Войтенок Н. Н. Проблемы гематологии, 1975, Жз 3, с. 48,