Способ определения экдистерона в культуральной среде

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 09) (И) зш С 12 1/32 4ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИк АвтОРсному свидетельству ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССОРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Институт биологии развитияим. Н.К.Кольцова и Институт общейгенетики АН СССР(56) 1. Полуэктова Е.В., Митрофанов В.Г., Кокпаков В.Т. Действиегормонов насекомых на пуффинг хромосом слюнных желез ВгозорМ 1 ачг 11 ьз БцгС культивируемыхы чегго. Сообщение 1, Изменение пуффинга при культивировании желез всреде С. Онтогенез, 1980, т.11В 2, с. 175-180 (прототип) .(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКДИСТЕРОНА В КУЛЬТУРАЛЬНОИ СРЕДЕ, преду- .сматривающий вццеление иэ личинки.Ргозор 1111 а чгх 1 хз последнего личиночного возраста слюнной железы,ее выдерживание в испытуемой культуральной среде при 20-22 С,приготовление давленного ацетоорсеиновогопрепарата этой железы с последующиманализом спектра пуфов хромосом, о т,л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью сокращения времени определения,анализ спектра пуфов проводят в индикаторных участках хромосом с первичной реакцией на экдистерон и поналичию. реакции в участках Х-А-б 2-Д-З, З-С, З-Сг, 4-Осудят оналичии в среде экдистерона.С:ЪЦель изобретения - сокращение времени определения.Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения экдистерона в культуральной среде, предусматривающему выделение из личинки ЛгозорМ 1 а ч 1 г 11 з последнего личиночного возврата слюнной железы ее выдерживание в испытуемой кульо туральной среде при 20-22 С, приго товление давленного ацетоорсеинового препарата этой железы с последующим анализом спектра пуфов хромосом, по 50 11306Изобретение относится к сельскому хозяйству и биологии и может быть использовано в практических целях в качестве экспресс-тест-системы для биологически активных веществ, 5Известен способ определения экдистерона в культуральной среде посредством пуффинга хромосом слюнных желез РгозорМ 1 а тг 1 з, Личинок (30-40 шт.) отбирают из массовых 10 культур в момент 2-й линьки на 48-м часе Ш -го возраста, выделяют из них слюнные железы и переносят в культуральную среду Схимически определенного состава, культивируют 15 железы в ней 0,5-24 ч в бюксах или пеницеллиновых флаконах, содержащих 1 мл среды Сбез гормона или с гормонами насекомых, Затем железы переносят в 17-ный раствор ацето орсеина на 2 ч при 22 С или 12-14 чОпри 10-14 С, после окрашивания жеолез готовят давленные препараты их по рутинному способу и проводят кариологический анализ дистальной 25 части железы (10 шт.), просматривая экспрессию спектра пуфов в десяти ядрах каждой из желез. На каждом из сроков анализируют в среднем 12200 районов хромосом в среде С, ЗО 12400 районов - в среде с ювенильным гормоном, 12200 - в среде с экдистероном, Всего анализируют в среднем 36800 районов хромосом в течение 15 дн на каждом сроке инкубации желез И .Недостатком известного способа является то, что кариологический анализ его продолжителен, сложен и трудоемок, так как включает в себя спектр пуфов всего генома, большинство из которых реагируют на экдистерон неспецифично, т.е. чувствительны как к экдистерону, так и к ювенильному гормону. 45следний проводят в индикаторных участках хромосом с первичной реакцией на экдистерон и по наличию реакции в участках Х-А, 2-Д-З, З-С, 3-6-2, 4-Ссудят о наличии в среде экдистерона.П р и м е р. Отбирают личинок 0 гозорЬд 1 а чг 1 з во время 2-й линьки. Выделяют слюнные железы из личинок 48-го часа П 1 -го возраста в 0,67.-ном растворе ИаС 1. Переносят в бюксы (диаметр 25 мм, высота 25 мм) с 1 мл среды Ссоставы (концентрация веществ в мг/100 мл трижды дистиллированной воды):ИаС 1 400,0 Лейцин 30,0 КС 1 160,0 Аргинин 40,0 ИаН РО 2 Н О 50,0 13-Аланин 50,0 ИаНСО 40,0 Глицин 30,0 СаС 1 6 НО 5,0 Серин 30,0 ИВС 12 6 Н О 25,0 Пролин 150,0 Трис 300,0 Фенилаланин 20,0 ФеноловыйкрасныйТирозин 3 Лизин НС 1000 Глутаминовая кислота 80,0 Аспарагино,0 вая кислота 30,0 100,0 Триптофан 10,0 50,0 Трионин 40,0 1,0 0,0 Цистеин НСГлутаминМетионинХолинхлоридИнозит 5,0 Изолейцин 20,00,7 Фолиеваякислота 0,450,0 Валин 30,00,4 Никотинамид 0,40,4 Пантотенаткальция 0,4 Гистидин НС 0 40,0 Рибофлавин 0,04 Глюкоза 300,0 Эмбриональнаятелячья сыворотка 57-ная рН 6,9 + 1 мг/мл экдистерона "Бегча", ФРГ.Культивируют железы в течение 30 мин при 20-22 С в герметическихОусловиях, Окрашивают в 17.-ном растворе ацетоорсеина в течение 2 ч при 20-22 С или 12-14 ч при 10-14 С.О о Ж-АланииПеридоксинТиамин НС 1 Готовят давленные препараты желездля чего переносят железу из краски на предметное стекло, краску удаляют; помещают железу в каплю насыщенного раствора хлоралгидрата (5 г в 2 мл воды); быстро (через 3-4 с) смывают его 457-ной уксусной кислотой; помещают железу в каплю 507.-ной молочной кислоты; покрываЗаказ 9520/22 . Тираж 521 Подписное ВНИИНИ Государственного комитета СССР по делам изобретений.и открытий 113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ют покровным стеклом, прижимая егок предметному стеклу.Проводят карнологический анализпяти индикаторных пуфов в районахХ-А, 2-Д-З, З-С, 3-6-2,4-С, по экспрессии которых судято наличии экдистерона в культуральной среде. В среде без экдистеронаиндикаторные пуфы не формируются,Таким образом, предлагаемый способ определения экдистерона в культуральной среде посредством пуффинга индикаторных участков в поли-. тенных хромосомах ЭгозорЬь 1 а чгз.1 ъз технически прост, сокращает продолжительность анализа в 15 раз (анализ по предлагаемому способу продолжается 1 день, по известному - 15 з дней) . Объем анализируемого материала сокращается в 73 раза(по предлагаемому .способу анализируют 500 участков хромосом, по известному 36800 участков) .ф Разработанный способ определенияэкдистерона в культуральной средепозволяет использовать индикаторныерайоны на экдистерон всех насекомых,обладающих тканями с политенным 15 кариотипом.