Способ получения полиадениловой и полиинозиновой кислот

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК А 1 4 С 07 Н 21/00 19 34 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЬСТВУ АВТОРСКОМУ СВИ(21 (22 (46 (71 Т осится к биотехферментативного мерных гомополири ет быть испольэо енетике и молекумолярном соотношении фата (0,9- дят в ции Е зу и 12-15 ляется снилучшение ка ия биологиче продуктов. в том: чтоФ зин-моноин-трифосра фосроститловой ипроцесс выделения поли слоты (поли-А) за счет ГОСУДАРСТВЕННЬ 1 Й НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институтбиологически активных веществ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИАЛЕНИЛОВОЙ И ПОЛИИНОЗИНОВОЙ КИСЛОТ(57) Изобретение относится к биохи-мии и биотехнологии и может быть использовано для получения полиадениловой и полиинозиновой кислот, широко1 Изобретение отн нологии и касается синтеза высокополи бонуклеотидов и мож вано в медицине, г лярвой биологии. Целью изобретения я жение себестоимости и чества за счет повыше кой активности целевых Способ заключается используют смесь аден фосфата (АИФ) и аденоприменяемых в медицине, генетике и молекулярной биологии. Целью изобретения является снижение себестоимости и улучшение качества за счет повышения биологической активности целевых продуктов, Изобретение заключается в реакции поликонденсациисмеси аденозин-манофосфата и аденозин-трифосфата в молярном соотношении (0,9-1,3):1 полинуклеотидфосфорилазой в присутствии ферментной фракции клеток Е.со 11, ацетилфосфата, ионов магния и буфера трис-НС 1 рН 7,3-7,5, при температуоре 12-15 С с последующим отделением белка смесью хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 2,5:1 и вы. делением целевого продукта трехкратным переосаждением калиевой соли полинуклеотида одним объемом этанола из буферного раствора фосфата калия. 1,3):1, при этом процесс провоприсутствии ферментной фрак.со 11, содержащей аценилаткинаацетаткиназу при температуреС, рН 7,5-7,3. Выделение цеевого продукта осуществляют преимуественно трехкратным переосажлением алиевой соли полинуклеотида бдним бъемом этанола из буферного раствофата калия, что позволяет уп 1470738ращения числа стадий с 5 и до 3 иуменьшить трудоемкость способа, Остановку реакции осуществляют преиму. -щественно добавлением в реакционнуюсмесь хлороформа и изоамиловогоспирта в соотношении 2,5:1, что позволяет сохранить. высокую полимерностьобразовавшегося полинуклеотида, темсамым повысить качество целевого продукта.Предлагаемый способ получения высокомолекулярных поли-А и полиинозиновой кислот (поли-И) заключаетсяв следующем. Готовят реакционную 15смесь, содержащую АМФ и АТФ в молярном соотношении (0,9-1,3):1, я также ионы магния, буфер трис-НС 1 рН7,3-7,5, ацетилфосфат, ферментнуюфракцию Е.со 1 х и полинуклеотидфосфорилазу (ПНфазу). Реакцию проводятпри 12-15 С. Остановку реакции осубществляют преимущественно добавлением смеси хлороформа и изоамиловогоспирта в соотношении 2,5:1. Выделение 25готового продукта осуществляют трехкратным осаждением калиевой солиодним объемом зтанола из буферногораствора фосфата калия. Для полученияполи-,И полиадениловую кислоту, содержа щуюся в реакционной смеси, подвергаютдезаминированию известным способом.Непрореагировавшие мономеры АМФ иАТФ после регенерации (отделениянеорганического фосфятя), например,на смоле АВ 17 2 могут быть вновьиспользованы для синтеза поли-А).В результате получают препаратполи-А с мол.массой 200-250 тыс.Дальтон (коэффициент седиментации 4014,8 ЙО,З Б), общий выход полинуклеотида составляет 56-58%.Известно использование ферментных фракций Е,со 1 х для синтеза различных компонентов нуклеиновых кис лот, однако в предлагаемом способе ферментная фракция используется по другому функциональному назначению, а именно для осуществления сопряженных ферментативных фракций, ведущих к образованию поли-А из смеси АМФ и АТФ, что позволяет получить новый неочевидный положительный эфФфект, заключающийся в повышении степени поликонденсации и, следователь- . но, к повышению молярной массы целе 55 вого продукта.П р и м е р 1. Приготовление фермнтной фракции Е.со 13 10 г клеток Е.со 1 х МК Е 600 суспендируют в 45 мл буфера А=500 тыс.) и 5 мл 40%-ного раствораполиэтиленгликоля (мол.масса = 6 тыс.)смесь перемешивают 20 мин и центрифугируют в течение 15 мин при3 тыс,об/мин. Верхнюю фазу сливаюти замеряют концентрацию белка спектрофотометрическим методом. Обычноконцентрация белка составляет14 мг/мл, Выход ферментной фракции50 мл или 700 мг белка. Этого количества достаточно для получения 370 г поли-А.Получение поли-А. Готовят реакционную смесь, содержащую 1,3 ммоль АМФ, 1,2 ммоль АТФ (соотношение 1,08:1); 0,02 моль трис-НС 1 рН 7,4, 0,05 ммоль ацетилфосфятя, 1 ммоль хлористого мягния, 20 мг азида натрия, 50 мкл ферментной фракции (приготовленной кяк описано выше) н 0,5 мл препарата ПНФазы (150 ед,акт) Добавляют дистиллированную воду до объема 100 мл и смесь инкубнруют при 14 С, Степень превращения мономеров в полинуклеотид контролируют гель- фильтрацией на колонке с сефарозой 4 В. При достижении максимального превращения реакцию останавливают добавлением смеси хлороформа с иэоамиловым спиртом в соотношении 2,5:1 и интенсивно перемешивают в течение 30 мин, После центрнфугирования смеси и отделения водного слоя к нему добавляют 1 моль/л калийфосфатного буфера до конечной концентрации 0,1 моль/л и поли-А высаживают одним объемом охлажденного этанола. Переосяждение калиевой соли поли-А из калийфосфятного буфера повторяют дважды, затем поли-А растворяют в воде и лнофильно высушивают, Выход составляет 1,1 мысль включенных в полинуклеотид (поли-А) мономеров или480 мг, Спиртовый супернатянт содержащий непрореягировавшне мономеры, упаривяют ня ротационном испярителе и регенерируют на колонке со0738 ровавших мономеров и растворяют в 10 мл буфера 0,1 моль/л трис-НС 1 и рН 7,5, содержащего 1 ммоль/л хлористого магния и 1 ммоль/л ЭДТА, и добавляют 1,2 мл ледяной. уксусной кислоты. При непрерывном перемешивании небольшими порциями в течение 2- 3 ч прибавляют 1,2 г сухого нитрита натрия, Перемешивание продолжают до достижения отношения оптических плотностей П /П 1,6-1,7. После чего смесь охлаждают до температурыо(0-2) С, добавляют 1 моль/л фосфата калия рН 7,0 и полинуклеотид осаждают одним объемом спирта (этанола). Дважды переосаждают поли-И из буферного раствора фосфата калия одним объемом этанола. В результате получают 1,39 ммоль поли-И с молярной массой, 200-260 тыс.Дальтон,5101520 Формула изобретения 25 30 35 40 45 Составитель В,ВарламовТехред Л.Сердюкова Корректор О.Кравцова Редактор Н,Гунько Заказ 1434/27 Тираж 339 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета .по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,10 5 147смолой АВ 17 2, Получают смесь АТФ,АДФ, АМФ и после добавления ЛМФ(обычно 0,4 ммоль) до первоначального соотношения ЛМФ:АТФ, соответственно, 1,08:1 вновь используют в реакции биосинтеза поли-А. Дополнительно получают 0,64 ммоль поли-А. Общий выход поли-А составляет 58 Е к исходным мономерамМолярная массаполи-А 200-250 тыс. Дальтон, КоэфЭфициент седиментации равен 14,8+0,38.П р и м е р 2, Готовят реакционную смесь аналогично примеру 1 заисключением того, что исходные мономеры АМФ и ЛТФ берут в соотношении0,9:1, а реакцию проводят при 12 С,при рН 7,3. В результате получают1,730 ммоль поли-А (выход 56 Е) с молярной массой 200-250 тыс.Дальтон,П р и м е р 3. Поли-А получаютиз смеси АМФ и АТФ аналогично примеру 1 за исключением того, что исходные АМФ и ЛТФ берут в соотношении1,3: 1, а реакцию проводят при 15 Си при рН 7,5, В результате получают1,733 ммоль поли-А (выход 57 Е) смолярной массой 200-240 тыс. Дальтон.П р и м е р 4. Поли-А получаютаналогично примеру 1 за исключениемтого, что исходные ЛМФ и АТФ берутв соотношении 0,8:1, а реакцию проводят при 8 С, при рН 7,0. В результате получают 1,470 ммоль поли-Л (выход 49 Е) с молярной массой 150200 тыс, Дальтон,П р и м е р 5. Поли-А получаютаналогично примеру 1 за исключениемтого, что исходные АМФ и АТФ берутв соотношении 1,6:1, а реакцию проводят при 18 С и при рН 7,8. В результате получают 1,290 ммоль поли-Л(выход 43 Е) с молярной массой 180220 тыс.Дальтон.П р и м е р 6, Получение поли-И.Получают поли-А аналогично примеру 1, Отделяют поли-А от непрореагиСпособ получения полиадениловой и полиинозиновой кислот, предусматривающий проведение ферментативной реакции из исходного субстрата-нуклеотида с помощью полинуклеотидфосфорилазы с последующей ее остановкой смесью хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 2,5:1, и выделении целевого продукта осаждением полинуклеотида этанолом, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью снижения себестоимости и улучшения качества за счет повышения биологической активности целевых продуктов, в качестве субстрата используют смесь ЛМФ и АТФ в молярном соотношении (0,9 - 1,3):1, при этом в него дополнительно вводят ферментативный комплекс из клеток штамма Езспг 1 спа, со 1 д МКЕ 600, содержащий аденилаткиназу и ацетаткиназу, а ферментативную реакцию ведут при температуре 12-15 С и рН 7,3-7,5.