Способ получения иммобилизованных нуклеиновых кислот

А Н Союз Советски СоциалистическРеспублик И 838 Е ТЕ Н ИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬ нительное к авт. свид-ву(22) Заявлеиоо с присоединен (23) Приоритет (43) Опублико 6 (21) 2418988 М. 4 Н 21/00 заявкиГосударственный комнтет Совета Мнннотроа СССР но делам нэебретеннй н открытнй78,Бюллетень 29 53) УДК 577,16 ,07 (088.8) убликования описания 27.06,78 45) М, Куриненко, ф. ф, Шаги-Мухвметовв и Р вьщ 2) Авторы изобретения ий ордена Трудового тет им, В, И, Ульян ени государственный 71) Заявите всного вв-Ленинвзвнс нив 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЬ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С помощью этого олучение препаратов,точно большое количеспа возможноержвших доста тво нуклеиновыхсопержание нукле 5 к ревосход Изобретение относится к способу получения иммобилизоввнных на нерастворимомносител е нуклеино вых кислот, которыемогут быть использованы для афиннойхроматографии ферментов и белков, образующих комплексы с нуклеиновыми кислотами,В литературе описан ряд способовполучения препаратов иммобилизованнь 1 хнуклеиновых кислот при помощи коввлентного связывания с различными носителями ( 1При помощи указанных методов возможна иммобилизация квк одноцепочечных нуклеиновых кислот (РНК или денатурированная ДНК), твк и двуцепочечных,Эти методы являются двустадийнь 1 ми:первая стадия - активация носителя илинуклеиновой кислоть 1, вторая - взаимодействие носителя с нуклеиновой кйслотой,Известен также 5 -триа зиновийспособ иммобилизации нуклеиновых кислот,позволяющий осуществить ковал ентноесвязывание. с носител ем, представляющимсобой полимер декстрана - сефадекс как одноцепочечных нуклеиновых кислот (РНК или денатурированная ДНК), так и вдоль пепи нвтивной (двуцепочной) ДНК (21,В соответствии с этим методом связывание производят следующим образом,К носителю (сефадекс), отмытомуводой и 0,1 М боратным буфером, добавляют раствор цианурхлорида в ацетоне, Активацию носителя проводят в течение 30 мин на холопу, стабилизируя рН добавлением 4 н, К аОН, Активированный носитель промывают раствором ацетона, дистиллированной водой, боратным буфером и приливают раствор нуклеиновой кислоты, Стадию связывания нуклеиновых кислот проводят при перемешивании в течение 16 ч, Для удаления непроревгировввших высокореактивных хлоридных групп цианурхлорида полученные препара ты промывают 1 М аммиачньг 1 буфером.иновых кислот, иммобилизованных другими методами.Однако этот способ имеет ряд недостатков, В ряде случаев количествануклеиновых кислот, содержащихся виммобилизованньх препаратах, бываетнедостаточно, и такие препараты обладают малой сорбционной емкостью.Кроме того, как и другие способыиммобилизации нуклеиновых кислот,б -триаэиновый способ также двустадиен и включает стации активацииносителя и взаимодействия вктивированного носителя с нуклеиновой кислотой.Целью изобретения является упрощение процесса .и повышение выхода целевого продукта,Укаэанная цель достигается за счеттого, что в качестве носителя используют растворимый полимер декстрана-полиглюкин, 20Способ обычно осуществляют следующим образом,Раствор нуклеиновой кислоты смешивают с растворимым полимером декстрвна (полиглюкин), полученную смесь обрабатывают цианурхлоридом, что приводитк иммобилизации нуклеиновой кислоты нвносителе, При этом комплекс нуклеиновая кислота-носитель переходит в нераст-воримую форму. 30Весовое соотношение нуклеиноваякислота /полиглюкин обычно равно 1:300и выше в сторону увеличения содержания нуклеиновой кислоты.Весовое соотношение связанные поли- имеры/ пианурхлорид чаще всего составляет 2:1,Количество связанных нуклеиновыхкислот определяют по содержанию неорганического фосфора в полученных препаратах.При излучении влияния соотношениянуклеиновая кислота/полиглюкин в реакционной смеси на выход конечного продукта (иммобилизованной кислоты) показано, что он не зависит от соотношения.Это дает возможность, применяя пред лагаемый способ, получать препараты ссодержанием в них .нуклеиновых кислот,значительно превышающим то, которое Иуказано в приведенном ниже примере, изависящим только от исходного количествануклеиновой кислоть 1, взятой для иммобилизации.Таким образом, предлагаемый способ 55является экономически более выгоднымБНИИПИ Заказ 4204/21филиал ППП Патент, г. по сравнению с прототипом, так как значительно проще в технологическом соотношении и позволяет получать препаратыс большим содержанием нуклеиновйх кислот.П р и м е р, 300 мг полиглюкинарастворяют в 3 мл 0,1 М боратного буфера (рН 9,2), приливают 3 мл раствораДНК или РНК (2-6 мг/мл в 0,14 ММ аС ), осторожно перемешивают ивыливают в чашки Петри, Далее цобввляют по каплям 1,5 раствора цианурхлорида в ацетоне (100 мг/мл), Реакциюпроводят в течение 30 мин при комнатной температуре, поддерживая рН. впределах 9,2 добавлением буфера,Образовавшийся бел ь 1 й гель отмывают100 мл смеси ацетона с дистиллированнойводой (1:1) и 100 мл 0,1 М боратногобуфера,Содержание нуклеиновых кислот в препаратах, полученных при данном соотношении нуклеиновая кислота/полиглюкин,составляет 20-25 мг на 1 г геля, Этосоответствует 80% исходного количествануклеиновой кислоты, взятой для иммобилизации, и примерно в 2 раза превосходит содержание нуклеиновых кислот в препаратах, полученных по известному методу.формула изобретения1. Способ получения иммобилизованных нуклеиновых кислот путем ковалентного связывания с носителем, представляюшим собой полимер декстрана, при помощи цианурхлорида, о т л и ч а ю щ и й -с я тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, в качестве носителя используютрастворимый полимер декстрана - полиглюкин,2, Способ по п, 1, о т л и ч в ю -щ и й с я тем, что весовое соотношение нуклеиновая кислота/полиглюкинсоставляет 1:300 и выше в сторонуувеличения доли нуклеиновой кислоть 1.3, Способ по пп, 1 н 2, о т л ич а ю щ и й с я тем, что весовоесоотношение связанные полимеры (нуклеиновая кислота и полиглюкин)/цианурхлорид составляет 2;1,Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе:1.3 ООЬЕ аВ 11 у,Ч,10, ИОЭ)Э. 424-427, 1974,2. Авторское свидетельство СССРХ 462824, кл, С 07 33 473/00,27.04.7 3. Тираж 559 ПодлисноеУжгород, ул. Проектная, 4