Способ идентификации вирусов

(51) М. КлР С 12 К 700 осударотаеннын номнтетСовета Мнннстроа СССРпо делам нзобретеннйи откропнй 43) Опубликовано 25 08 77 Бюллетень345) Дата опубликования описания 27,09.77(72) Авторы изобретения В. Я. Кармышева, Л. М. Фарутина, Т. А. Иванниковаи М, И. Саталкина ститут полиомиелитаАМН ССС ирусных энцефалитов) Заявител 4) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСО етженной клеточной культуре р иммунную сыворотку, коми идентифицируют вирус по ю цитолитического эффекта.ют следующим образом.ствительных к предлагаемо. чОи 150000 - 200000 мл, рас.ам,.пенициллиновым флако.теклами или пластинами с ращивают на стандартных(Игла, 199 и т,д. с 10% Для этого к зарадобавляют в избыткеплемент и красительналичию или отсутствиСпособ осуществляВзвесь клеток, чувму вирусу, в концеитрацисаживают по пробиркнам с покровными слунками, Клетки вькультуральных средах Изобретение относится к вирусологии и каса ся анализа биологических материалов.Известен способ идентификации вирусов путем пассажа:вируссодержащего; материала на культуре клеток с последующим добавлением иммунной сывороткй,Недостатком известного способа является длительность определения в связи с необходимостью внесения смеси вируса с сывороткой во вновь выращенные клеточные культуры и инкубации в течение 3 - 7 и более суток.Целью изобретения является ускорение спосонормальной бычьей сыворотки), на которых обычно выращивают используемую клеточную культуру.Вируссодержащий материал пассируют на выращенной клеточной культуре до момента появления цитопатического эффекта или предполагаемого на. копления вируса, затем культуральную ереду уда ляют и споласкивают клетки той же культуральной средой без сыворотки; прогретой до 37 С. После этого к клеточному слою добавляют стандартные иммунные сыворотки.и комплемент в соотношении 1:1 в объеме, покрывающем исследуемые клетки, и помещают в термостат при 37 на 30 - 60 мин. Сливают смесь сыворотки с комплементом, добавляют 0,025 о ный раствор трипанового синего, че. .рез 2 мин сливают его и просматривают состояние монослоя в световом микроскопе. Наличие набухших, округляющихся лизированных клеток, окра. шенных трипановым синим указывает на присутствие идентифицируемого вируса.Каждую стандартную сыворотку рекомендуется использовать в 4-5 пробах,Все сыворотки и комплемент морской свинки предварителыю проверяют иа отсутствие неспецифической штотоксичности на клеточные культуры,569596 Составитель С, Маналина Теяред Н. Андрейчук КорректорС, Ямалова Тираж 5 й Подписное: ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по данам изобретений и открытий 1130 5, Москва, Ж, Рауаская наб., д. 4/5Заказ 2973/П Фиднал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3Инактивацию сыворотки производят прогреванием при 56 С в течение 30 мин,Время непосредствеыой идентификации вируса 1 - 2 час/не считая времени первичного культивирования вируса (12 - 17 час).Приме р. Идентификация альфавирусов. Взвесьбычьей сыворотки (концентрация 150000 - 200 000 мл) в объеме 2 - 3 мл разливают по пробиркам.В пробирки .с выращенной клеточной культурой вносят исследуемый вируссодержащий материал в .объемен 0,1 - 1 мл. 11 осле адсорбции вируса вируссодержвп 1 ий материал удаляют и моюслой клеток в пробирках заливают 1 укаэанной. культуральюй средой с 2% нормальной бычьей сьворотки, Через 12 - 17 час при появлении первых признаков цитопатического. эффекта культуру споласкивают указан. юй культуральной средой, прогретой при 37 С, и добавляют смесь одной из иммунных сывороток (к альфавирусам, вирусам клещевого энцефалита, ко. ри) с комплементом в соотношении 1:1 в обьеме 1 мл (сьворотки при титрах 1:1280 по РПГА разно. дят 1:6 - 1:7, свежий комплемент морской свинки 1:5 - 1:7), Пробы ставят в термостат при 37 С на 30 - 60 мин, Затем жидкость удаляют, наливают на монослой 0,025% ный раствор трипанового синего на физиологическом растворе на 2 мин и просмат. ривают пробирки в световом микроскопе, опреде. ляя наличие или отсутствие сильно разбухших лизированных окрашенных клеток,В примере лизированные клетки наблюдцдтся впробирках, зараженных вируссодержащим материалом, с иммунными сыворотками к альфавирусам и отсутствуют в пробирках с сьворотками к вирусам клещевого энцефалита и кори, что свидетельствует о том, .го в вируссодержащем материале содержит.ся вирус из группы аль равирусов.10 Срок идентификации вирусов сокращается от3 - 7 суток до 1 - 2 час. Это обеспечивает отсутствие вторичного заражения клеточных культур смесью вируса с сыворотками и следовательно отсутствие длительюй ннкубации для развития цитопатическо.1 а го эффекта, При этом не требуется никакого специ.альюго оборудования или дополнительного обучения исполнителей. Формула изобретения 20Способ идентификации вирусов путем пассажавируссодержащего материала на культуре клеток споследующим добавлением иммунной сыворотки,отличающийся тем, что, с целью ускоренияспособа, к зараженной клеточной культуре добав.ляют в избытке иммунную сьворотку, комплементи краситель и идентифицируют вирус по наличиюили отсутствию цитолитического эффекта,