Способ получения сыворотки крови телят для культивирования клеток и вирусов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ 3 А 1 74 9) ъЖ. ЕСПУБЛИК 16 1)5 С 12 й 5/00, А 6 И ОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ ИЗО К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко(56 Авторское свидетельство СССР % 1015894, кл. А 61 К 35/16, 25.06.81,Сыворотка крови телят коров жидкая для культур клеток, Регламент производст- . ва, 1989. Изобретение относится к ветеринарной клеточной биотехнологии, в частности к способу культивирования клеток животных и человека ин витро.В биотехнологии клеток и тканей животных имеют широкое применение сыворотки крови, которые служат одним из компонентов питательных сред тканевых культур, Требования к сывороткам возросли в связи с широким использованием в ветеринарии, медицине, гибридомной биотехноло. гии, а также проведением исследований по генетической трансформации клеток,Цель изобретения - повышение пролиферации клеток и увеличение накопления вирусов,Поставленная цель достигается посредством того, что кровь берут у новорожденного теленка, имеющего массу тела не менее 2(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ КРОВИ ТЕЛЯТ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК И ВИРУСОВ(51) Использование: биотехнология и ветеринария, Сущность изобретения: новорожденного теленка взвешивают и фиксируют в правостороннем горизонтальном положении, Кровь берут из яремной вены с помощью стерильной системы до первой выпойки теленку молозива. Масса тела новорожденного, осуществившего рефлекс стояния на ногах в течение 0,3 - 1,0 ч после рождения, составляет не менее 25 - 21 кг. Объем извлекаемой крови не должен превышать 15 - 17 мл на 1 кг живой массы теленка, После формирования сгустка сыворотку отделяют центрифугированием, Содержание у-глобулина в сыворотке не превышает 20. 25 - 27 кг до первой выпойки ему молозива и осуществившего рефлекс стояния на ногах в течение 0,3 - 1,0 ч после рождения, в объеме 15 - 17 мл на 1 кг живой массы,После обработки пуповины теленка взвешивают, переводят в помещение для взятия крови и фиксируют в правостороннем горизонтальном положении на специальном столе. Кровь берут из яремной вены с помощью стерильной системы в стерильные флаконы емкостью 250 - 1000 мл. Флаконы с кровью оставляют на 3 - 4 ч при 20 - 35 С для формирования сгустка, после чего помещают в холодильную камеру (температура 6 С) на 12 - 24 ч, где происходит ретракция сгустка и отстаивание сыворотки, При наличии центрифуги через 1 - 2 ч отстоя флаконы с кровью помещают в центрифужные стаканы и. центрифугируют 30 -1742323 ния в присутствии предлагаемой сыворотки не отличается от величины эффективности клонирования при использовании эмбриональной сыворотки; культивирование перевиваемой культуры клеток 3-96 - сравнительный анализ данных по морфоло 40 гии, цитохимии и чувствительности к вирусу щелочной фосфатазы и чувствительность к вирусу Коксаки ВЗ, клетки образуют хороСоставитель В. СвиридоваРедактор И. Дербак Техред М,Моргентал Корректор Н. Ревская Заказ 2261 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 45 мин при 1,5 тыс, об/мин (известная методика).Сыворотка крови новорожденных телят до первой выпойки молозива контролируется по следующим показателям; общий белок 5 35+15 г/л, содержание у-глобулинов не более 2 от общего количества белка, содержание свободного гемоглобина не более 0,5 г/л.П р и м е р 1. Родившийся теленок осу ществил рефлекс стояния на ногах втечение 45 мин, имея массу 27 мг. От него получают 405 мл крови,. выход сыворотки 50, т,е.200 мл сыворотки. Содержание у-глобулинов 1,2, Сыворотку используют для куль тивирования:суспенэионного штамма перевиваемой почки свиньи (ППС), при этом эффективность клонирования 50 - 60)ь, плотность популяции 7 - 8 10 кл/мл среды, время уд воения популяции 27 - 30 ч; контроль - телячья сыворотка, 20 - 35 О, 4 - 5 10 кл/мл, 30 - 35 ч соответственно; при культивировании перевиваемой линии клеток Р К-ВЮ (почка эмбриона овцы), хронически инфици рованной вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС) - индекс пролиферации 5,1-5,2, время формирования монослоя 3 - 4 дня, титр выделенного антигена ВЛ КРС 1:20; контроль - телячья сыворотка, 4,5, 4 - 30 5 дней, 1:2 - 1:10 соответственно; контроль - эмбриональная сыворотка, 5,2, 3 - 4 дня, 1:20 соответственно; при культивировании стромальных клеток костного мозга в монослое - эффективность клонирова показал, что культивирование клеток с добавлением предлагаемой сыворотки не изменяет их морфологию, активность 45 ший сплошной монослой и выдерживают без смены среды 7 сут культивирования, как и в контроле (эмбриональная сыворотка).П р и м е р 2. От теленка весом 30 кг получают 450 мл крови, выход сыворотки 50 О/, т.е. 225 мл с содержанием у-глобулинов 1,1.На этой сыворотке культивируют культуры клеток легкого эмбриона коровы и перевиваемой линии клеток, при заражении которых короновирусом титр вируса составляет на 1,5 - 2,29 выше, чем при заражении аналогичных культур, выращенных на телячьей сыворотке.Сыворотка крови новорожденных телят до выпойки молозива для культивирования клеток и вирусов по своим биологическим и физико-химическим свойствам аналогична эмбриональной сыворотке, по рост-стимулирующим свойствам превосходит сыворот:- ку крови телят.Предлагаемый способ получения сыворотки позволяет сохранить жизнь теленка с последующим нормальным развитием.Сыворотка крови новорожденных телят, полученная по предлагаемому способу, может быть применена в биотехнологии культивируемых клеток животных и человека, для удовлетворения потребностей ветеринарной,медицинской и биологической науки, а также биопроизводства вирус-вакцин, диагностикумов, других биологических препаратов.Формула изобретен и я Способ получения сыворотки крови телят для культивирования клеток и вирусов, включающий взятие крови, отделение сыворотки, контроль содержания у-глобулинов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения пролиферации клеток и увеличения накопления вирусов, кровь берут у новорожденного теленка, имеющего массу тела не менее 25 - 27 кг до первой выпойки ему молозива и осуществившего рефлекс стояния на ногах в течение 0.,3 - 1,0 ч после рождения, в объеме 15 - 17 мл на 1 кг живой массы.