411090

и зцФ. ехнь еиа М ПИСАН И ЗОБРЕТЕН И Союз СоветскихоциалистицескихРеспублик ВТОР СКОМ ТЕЛЬ СТ висимое от авт. свидетельства ЛЪ 1, Кл, С 07 д 51/5 Заявлено 26.Х 1.1971 ( 171807с присоединением заявкиПриоритет сударственный комитетовета Министров СССРоо делам изасретенийи открытий бликовано 1 47 857 7 07(088.1974. Бюлле нь 2 .И 1,19 ата опубликования описани Авторыизобретения мпен и Э. Я. Гре Заявитель Ордена Трудового Красного Знамени нститут органического синтеза АН Латвийской ССИзобретение относится к усовершенствованному способу получеция соединений, которыемогут найти применение в биохимических исследованиях.Известен способ получения С 4-уридин- 5трифосфата из С 4- оротовой кислоты в присутствии ферментов, выделенных из Езсйепс 1 ъ)а со 11 в качестве катализатора.Однако данный способ требует приготовления специального компонента реакционной 10смеси - 5-фосфо.,0-р ибозил-пирофосфата,что весьма затрудняет и усложняет процесс.По предлагаемому способу получения рибонуклеозид-трифосфатов, меченых изотопами С" или Н, приготовления специального 15компонента реакционной смеси не требуется,рекомендуемый способ заключается в том, чтосоответствующие меченые пуриновые или пиримидиновые основания подвергают ферментативному превращению в присутствии Р-рибозы, адецозин-трифосфата, или в случаесинтеза меченого аденозин-трифосфата используют уридин-трифосфат, ионов Мд+,пируваткиназы и фосфоенолпирувата, применяя в качестве катализатора ферментную 2фракцию бесклеточного экстракта Езс 11 епс 1 н 1 асо 11 АВ 259 Н 1 г 3000 с последующим выделением целевого продукта известным способом,Процесс обычно протекает при 3 С и рН 7,8 в течение 45 мин, Выход нуклсозид-трнфосфата (по меченому основанию) не менее 90%. Радиохимическая чистота 96 - 98%,П римеры.а) Приготовление бесклеточных экстрактов Е, со 1 АВ 259 Н 1 г 3000.Клетки выращивают ца пептонной среде с интенсивной аэрацией при 37 С, осаждают в центрифуге, отмывают от среды буферным раствором (0,01 1 И трис-НС 1, р 1-1 7,8; 0,005 И МдС 1). Бесклеточные экстракты готовят растиранием клеток со стеклом при 1 - 2 С, разбавляют полученную массу двукратным объемом буфера (0,1 М трис-НО, рН 7,8; 0,05 М МдС 1,), вносят дезоксирибонуклеазу (0,01 мг/ /мл раствора), цецтрифугируют 20 мцн при скорости вращения в низкоскоростной центрифуге 10000 об/миц, Надосадочную жидкость подвергают ультрацецтрифугированцю при 100000 д в течение 1 часа. Полученный экстракт быстро замораживают и храцят при - 20 С. Непосредственно перед внесением в реакционную смесь бесклеточный экстракт нагревают при 50 С (в водяной бане) 3 мин, образовавшийся осадок удаляют центрифугированием, надосадочную жидкость используют в качестве ферментпой фракции Езс 11 епс 111 а со 11,411090 3 Составитель В. 7 Кестков Техред Л, Богданова Корректор А, Дзесова Редактор Л, Бмельянова Заказ 254/2 Изд.230 Тираж 506 Подписное ЦИИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, 7 К, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 б) Синтез рибонуклеозид-трифосфатов,меченных Сф или Нз.Синтез уридиц-трифосфата. Реакциошую смесь, содержащую (в мкмоль/мл): С 4 или Н-ур ацила 1,8; О-рибозы 9,0; аденозип-тр ифосфата 1,5; фосфоенолпирувата 10; трис-НС 1,рН 7,8 100; МдС 1 25; бесклеточного экстракта 0,14 ыл на 1 мл реакционной смеси, инкуоируют 45 мин при 37"С (в водяном термостате). По истечении 30 мин инкубации дополнительно вносят (на 1 мл смеси): 1,5 мкмолей адепозин-трифосфата, 10 мкмолей фосфоенолпирувата и 30 .мкг пируваткиназы. Инкубацию прекращают, помещая смесь в кипящую водяную баню на 1,5 - 2 мин, Образовавшийся осадок удаляют в низкоскоростной центрифуге, а падосадочпую жидкость (после концентрирования в ротационном испарителе при 32"С) наносят па бумагу %15 (10 СЕ 2 ао па 1 см старта) для хроматографированпя в системе; изомасляная кислота - вода в концентрированн гидроокись аммония (66: 33: 5) нисходящим способом в течение 20 час, Хроматограммы сушат в струе холодного воздуха (2 - 3 часа), отмывают эфиром (в течение суток) или подвергают нисходящей хроматографии в системе к-бутанол - ацетон - уксусная кислота - 5%-ная гидроокись аммония - вода (9: 3: 2: 2: 4) (12 - 15 час) прп 3 - 4 С. Зоны урпдин-трифосфата вырезают и элюируют водой. С целью получения продукта в виде аммоппевой соли элюат обраоатывают Вовех 50/1-1+, смолу оприльтровывают на мембранном фильтре, фнльтрат пейтрализуют 5%-ным раствором гидроокиси аммония. В случае необходимости получеш 1 ый раствор аммонпевой соли меченого уридип-трифосфа 1 а концентрируют в ротационном испаритсле (32"С), Препарат замораживают и хранят при - 20 С.в) Синтез 5-фторуридип-трифосфата. В качестве меченого соедшепия используют 1,8 мкмоль 5-фторурацпла а 1 мл реакционной смеси). В остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен оппсанному для уридиц-трифосфата.г) Синтез цитидип-трифосфата. Для синтеза цитидиц-трифосфата бесклеточный экстракт Езс 11 епс 1 па со 11 приготовляют по описанной выше методике, но трис-НС 1 в буферных растворах во всех случаях заменяют глицинатом калия (0,05 М, рН 8,1). В ка:ествс меченого соединения используют цитозип (1,8 мкмоль/мл смеси). Реакционная смесь имеет состав, описанный для сшггеза уридин-трифосфата, с той разницей, что дополни 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4тельно вносят 10 мкмоль/мл смеси КН 4 С 1, а трис-НС 1 заменяют глицинатом калия - 100 мкмоль/мл смеси, рН 8,1. Процесс синтеза и очистки препарата аналогичен описанному для уридин-трифосфата.д) Синтез аденозин-трифосфата.В качестве меченого предшественника используют аденин (1,8 мкмоль/мл смеси). Реакционная смесь имеет состав, описанный для синтеза уридин-трифосфата, с той разницей, что аденозин-трифосфат заменяют аналогичным количеством уридин-трифосфата, Процесс синтеза и очистки препарата аналогичен описанному в случае синтеза уридин- трифосфата.е) Синтез гуанозин-трифосфата.В качестве меченого соединения используют 1 уанин (1,0 мкмоль/мл смеси). Состав реакционной смеси, а также процесс синтеза и очистки аналогичен описанным для синтеза уридин-трпфосфата.Полученные С 4- и Нв-нуклеозид-трифосфаты анализируют хроматографически в системах; 1) этанол - 1 Л 4 ацетат аммония - 0,1 М ЗДТЛ (75:29:1), восходящая, 18 час; 2) изомасляная кислота - вода - концентрированная гидроокись аммония (66: 33: 1,5), нисходящая, 18 час. Нуклеозид-трифосфаты подвергают также кислотному гидролизу, и полученные пуриновые и пиримидиновые основания идентифицируют в хроматографической системе; и-пропапол - НС 1 (17: 4 - вода до 250 мл), нисходящая, 20 час. Радиохимическая чистота препаратов составляет 96 - 98% . Основные характеристики УФ-спектров полученных нуклеозид-трифосфатов соответствуют характерным для них. Предмет изобретения1. Способ получения риоонуклеозид-трифосфатов, меченых изотопами С" или На, путем ферментативного превращения соответствующих меченых соединений в присутствии ферментов, выделенных из ЕзсйепсЫа со 11 в качестве катализатора, с последующим выделением целевого продукта известным способом, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве меченых соединений используют пуриновые или пиримидпповые основания и процесс ведут в присутствии В-рибозы, аденозин-трифосфата или в случае синтеза меченого аденозин-трифосфата используют уридин-трифосфат, ионов Мр-+, пируваткиназы и фосфоенолпирувата.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс ведут при 37 С и рН 7,8.