Способ денатурации дезоксирибонукл ей новых кислот и нуклеотидов

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУСоюз Советскими Социалистицеских РеспубликЗависимое от авт. свидетельстваЗаявлено 18.7111,1971 ( 1703301,/31-1 Кл. С 121 7/00 с присоединением заявкиПриоритетОпубликовано 27.1 Х.1973. Бюллетень3Дата Опублцковацця опцсацця 18.1.1974 осударотвенный комитетСовета Министров СССРоо делам изобретенийи открытий ДК 576.8.093,1(088 8) Авторыизобретения А. М вереццый, В. В. Симоиов, Л. П. ДацилецкЕ, Н. Коломыйцева и С. И. Сумицов Заявитель СПОСОБ ДЕНАТУРАЦИ И ДЕЗОКСИ РИ БОНУКЛ ЕИ НОВЫХ КИСЛОТ И НУКЛЕОТИДОВт Возможцость цолмратов ДНК с разцой Условия постацОвцц в црцмсрс 1.0,01 М буферный ра, содержацИй 0,01 М аццц сстацавлцвают до 8,8 - 9,0 гцело 1 с со. Д 1-1 К можно остацоцолучсццем стабцльй степсцью лецатурам с р 2. Исследуюстабцльцых ирена)о лсцату)спцц.пмсппга те жс, чтоытах цспоссьзцотРИС - 1-1 С, рН 7Процесс дсцат рнем р 1-1 растворассс дсц с)т 1 р с цц ца лсобом этапе сецаратов с разцо 20 чецця стспекц экспер В оп створ Т 25 Ха С 1. довсдс Про вцть ц цых пр 30 ццц.Изобретение относится к области медиципы, а имецпо к способам децатурации лсзоксирибоцуклеицовых кислот и цуклсотцдов, что важно для молекулярцобиологическцх исследований.Известец способ дсцатурацпи ДНК путем цагрсвация до 95 в 1 С в разлцчцых солевых растворах с последусощссм быстрым охла)кдеццем и ОоработкОст форксальдегидо:1.Однако этот способ связан со зцачцтельными затратами врсмеци.С целью ускорения процесса по предлагаемому способу обработку ведут при 5 - 25 С в присутствии первичных аминов, например, трцоксцметиламццомстаца.П р и м с р 1. Изучают децатурацшо ДНК в буфсрцых растворах ТРИСА и этацоламцца в присутствии 2 осо-ного формальдегила, а также влияние ца децатураццсо ряда факторов среды (иоццая сила, рН).Исследования проводят прц комнатной температуре 24 С, используя цативцую ДНК тимуса тслсцка 0,002 осо. К буферным растворам, содержащим ДНК, приливают коццецтрироваццый нейтрализованный раствор формальдегида (коцечцая коццсцтрация 2 осо), тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность раствора ДНК во времени при длицс волны 255 )с,)ск. За исходцсс поглощецис принимают оптическую плотность раствора ДНК без формальдепсда (с учетом эффекта развсдсцця).В опытах используют 0,01 сЧ раствор ТРИС - НСзСООН. Оо эффсктцвцостц рН па децатураццю ДНК судят по цзмецеьппо оптической плотцостчерез 60 )сси после добасзлсция формаль;сегида.В буферцых растворах ряда цервцчцых аминов, содержащих формальдсгцд, уже прц комцатцой температуре происходит Лецатурацця ДНК. Причем в ТРИС-буфере процесс практически завершс)ется через 5 сяссц,Дсцатурцрусопес действие в ТРИС-буфере зависит от рН ц цопцой силы растзора. НацОольшая эффективность цаолюдается в 0,01 М растворе црц рН 7,0 - 7,5. Прц рН 9 дсцатурации це наблюдается.398607 Сосгавптсль Т, ГоловинаТсхрсд Е, Борисова Корректор Л. Царькова 1 зсдактор В. Блохина Заказ 3694(17 Изд. Мв 2029 Тираж 467 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, )К, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 П р и м е р 3. Исследуют модификацию аминогрупп азотистых оснований денатурированпой Д 1-1 К и отдельных 11 уклеотидов в буферных растворах ТРИСЛ и этаноламина, Исследования проводят при комнатной температуре 24 С в 0,01 Ы растворах, рН 7,4.В опытах используют смесь дезоксирибонуклеотцдов аленина ц ццтозица или денатурированную ДНК тпмуса теленка. Депатурацию проводят прогреванием 0,01/о ДНК в 0,01 М ИаС 1 в кипящей бане в течение 10 мин с последующим быстрым охлаждением в ледяноп воде.К растворам смеси нуклеотидов или денатурированной ДНК, разведенным в 10 раз соотвстствугощц м буфером, приливают концентрированный нейтрализованный формальдегид (коцечцая концентрация 2), тщательно псрсмсшцвают и измсряют оптическую плотность во времени при длине волны 275 лглк. За псходцос поглощение принимают оптическую плотность растворов без формальдсгпда (с учетом эффекта разведсцця).Из полученных результатов следует, что в присутствии этацола мина взаимодействие формальдегида с денатурированной ДНК и отдельными цуклеотидами по своей эффективности олиз 1 о к взаимодействию в присутствии ТРИСА,П р и м е р 4, Исследуют способность ДНК, инкубированной различнос время в присутствии ТРИСА и формальдсгида, взаимодействовать с ацтнтелами сыворотки кролика, иммунизи рова нного комплексом метилированный бычий сывороточный альбумин - однотяжевая ДНК. Антитела реагируют только с денатурированными участками молекулы 5 Д 1-1 К. Реакцию останавливают подщелачиванием до рН 9,0.В результате кипячения раствора ДНК,содержащего ТРИС и формальдегид, способность ДНК реагировать с антителами резко 10 снижается, Кипячение при рН 9,0 полностьюсохраняет способность ДНК реагировать с антителами.Следовательно с помощью иммунохимического метода установлено, что при краткой 15 инкубации ДНК при комнатной температурев растворе, содержащим ТРИС и формальдегид, происходит денатурация ДНК, а процесс денатурации может быть остановлен изменением рН.20 При кипячении ДНК в присутствии ТРИСАи формальдегида происходит значительная модификация структуры ДНК, в результате которой ДНК теряет способность реагировать с антителами. Кипячение при рН 9,0 такого эффекта не вызывает. Предмет изобретенияСпособ денатурации дезоксирибонуклеиновых кислот и нуклеотидов путем обработки формалином, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса, обработку ведут при 5 - 25 С ,в присутствии первичных аминов, например, триоксиметиламинометана.