Способ определения кортикостероидов в плазме крови

)5 6 01 й 33/74 КОМИТЕТИ ОТКРЫТИЯМ ГОСУДАРСТВЕННЙО ИЗОБРЕТЕНИПРИ ГКНТ СССР чфф Юдроф. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ СКОМ ИДЕТЕЛ ЬСТВУ авлова Проблемы ,75-77.ОРТИКОохимии и зиологии. е объема в чистые пробирки идобавляют с помощьюмл флюоресцентного реая кислота:абсолютныи оотношении 7:3 приго мороженного слоя каждую пробирку микробюретки 0,5 актива (смесь сер этиловый спирт в оп име(21) 4624168/14(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КСТЕРОИДОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ(57) Изобретение относится к биможет быть использовано в фиЦель изобретения - сокращени Изобретение относится к биохимии, может быть использовано в физиологии и позволяет определять содержание кортикостероидов в корови, свидетельствующее об активности гипофизарно-адренокортикальной системы.Цель изобретения - сокращение объема плазмы за счет повышения чувствительности способа при одновременном повышении точности,Способ осуществляется следующим об-. разом,В пробирки объемом 4,мл помещают 0,1 мл исследуемой жидкости (стандарт, контроль, плазма крови) и добавляют 1,5 мл хлористого метилена, Пробирки встряхивают на лабораторной качалке в течение 3 мин и замораживают в течение 20 мин при -20 С в холодильнике или в течение 1 - 2 мин с помощью охлаждающей смеси этиловый спирт - углекислота, при этом холестерин и другие липиды "вымораживаются" с водой. Метиленхлоридный экстракт сливают с заплазмы за счет повышения чувствительности способа при одновременном повышении точности, Способ включает экстракцию кортикостероидов из 0,1 мл плазмы хлористым метиленом, замораживание плазмы с метиленхлоридным экстрактом и последующее сливание экстракта, Затем добавляют к экстракту флюоресцентный реактив (смесь абсолютный этиловый спирт - серная кислота в отношении 3:7) и измеряют флюоресценцию. Изобретение позволяет уменьшить минимально определяемое количество кортикостероидов в 15 раз. тавливается медленным приливанием кислоты в спирт при охлаждении). Пробирки встряхивают на лабораторной качалке в течение 3 мин. Верхний слой хлористого мети- лена отсасывают с помощью пастеровской пипетки, соединенной с водоструйным насосом, Через 1,5 ч измеряют флюоресценцию, По флюоресценции стандартов и контроля строят калибровочную кривую и находят содержание кортикостероидов в испытуемых образцах. В общей сложностиределение 50 проб занимает 3 - 4 ч. Способ поясняется следующим пр ом.П р и м е р. Определение кортикостерода в плазме крови крысы в хроническом пыте,1702321 Формула изобретения Способ определения кортикостероидов в плазме крови, включающий экстракцию плазмы метиленхлоридом, обработку метиленхлоридного экстракта смесью серной кислоты и этилового спирта с последующей регистрацией флюоресценции, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью сокращения обьема плазмы за счет повышения чувствительности способа при одновременном повышении точности, пробу с добавленным хлористым метиленом встряхивают, замораживают, а метиленхлоридный экстракт сливают. Составитель Н,Гуляева Редактор А,Маковская Техред М,Моргентал Корректор О.КундрикЗаказ 4541 . Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул, Гагарина, 101 Иэ хвостовой вены крысы набирают 0,26 мл крови и переносят в центрифужную пробирку. Пробу центрифугируют в течение 10 мин при 3500 об/мин, Отбирают 0,1 мл плазмы в пробирку обвемом 4 мл, В анало гичные пробирки наливают по 0,1 мл бидиСтиллированной воды (контроль) и стандартного раствора, содержащего 0,5 ,мкг/мл кортикостерона (стандарт). В каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлористого 10 ,метилена, встряхивают в течение 3 мин и затем замораживают в течение 20 мин при -20 С в холодильнике. Метиленхлоридный экстракт сливают с замороженного водного слоя и добавляют к нему 0,5 мл флюорес центного реактива. Пробирки встряхивают в течение 3 мин, хлористый метилен отсасывают и через 1,5 ч измеряют флюо, ресценцию стандарта, контроля и пробыпри длине волны возбуждения 470 нм, флю оресценции - 530 нм, При этом флюоресценцию стандарта выставляют равной100; Расчет содержания кортикостерона в плазме крови проводят по следующей формуле; 25Содержание корти костеронаЖА-дДСт Дкгде Ст - концентрация кортикостерона встандартном растворе; 30Дст - флюоресценция стандартного раствора;Дк - флюоресценция контроля;Дп - флюоресценция пробы. Получены результаты: Ст = 0,5 мкг/мл; Дст = 100; Дк = 5; Дп = 64.Содержание кортикостерона0,5 б 4 - 5100 - 5= 0 311 мкг/млПредлагаемый способ по сравнению с известным позволяет снизить обьем исследуемой пробы в 10 раз (т.е, может считаться микрометодом), уменьшить минимальное определяемое количество кортикостероидов в 15 раз, уменьшить количество используемых реактивов (хлористого метилена - в 5,3 раза; петролейный эфир не используется; этилового спирта и серной кислоты - в 6 - 8 раз), снизить трудоемкость определения (уменьшает количество операций и устраняет встряхивание руками), за счет чего сокращается время определения и повышается точность тестирования в 2 раза.