Способ определения активности холинэстеразы в крови и устройство для его осуществления

(19 01 й 33/6 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Изобретение отн может быть использо тивности холинэстера медицинской практиЦелью изобретен ние способа и повыш ления активности хол бавляют и обков осится к биохимии и вано для контроля акзы в крови человека, в е и токсикологии.ия является упрощение точности опредеинэстеразы в крови. ио- леобесь,С-Со риече- доОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В КРОВИ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ(57) Изобретение относится к биохимии иможет быть использовано для контроля активности холинэстеразы в крови человека,в медицинской практике и токсикологии,Цель - повышение точности и обеспечениеавтоматизации измерений. Цель достигаетНа чертеже представлена функ нальная схема устройства для осущес ния предлагаемого способа,Способ осуществляется следующи разом,Приготавливают реакционную см состоящую иэ трис-буфера рН 8,0 и БА-нафтилазо)дифенилдисульфид динат вая соль, трехводная). Смесь помеща кювету, добавляют пробу цельной кров ловека, перемешивают встряхиваниемся путем введения в реакционную смесь, состоящую из пробы цельной крови, трисбуфера и БАС-С, в качестве тиохолинового субстрата дитиохолинового эфира пробковой кислоты и определения активности холинэстеразы по времени полного гидролиза субстрата с помощью специального устройства. Специальное устройство состоит из известного устройства, в которое дополнительно введены электрически управляемый дозатор, дифференциатор, делитель напряжения, блок памяти, компаратор, Устройство обеспечивает цифровую индикацию времени полного гидролиза субстрата, Изобретение позволяет повысить точность определения примерно в 10 раэ, 2 с.п. ф-лы., 1 ил., 1 табл. субстрат-дитиохолиновый эфир р ой кислоты и фотометрируют.П р и м е р 1. Для измерения активности холинзстеразы в крови человека приготавливают реакционную смесь, содержащую 3,0 10 М трис-буфера рН 8,0 и 1,2 10 М БАС-О. Эту смесь в обьеме 5 мл помещают в медицинский флакон, затем в нее вводят 0,05 мл цельной крови человека и перемешивают смесь встряхиванием, Кювету устанавливают в фотометрический блок, в реакционную смесь добавляют 1 мл 5 10 М дитиохолинового эфира пробковой кислоты и фотометрируют с помощью специального устройства.Активность холинэстеразы в крови рассчитывают по формулев 1 К 1 60 107 Чкргде п 11 - количество микромолей суберилдитиохолина. подвергшегося гидролиэу при анализе;К 1 - температурный коэффициент, учитывающий зависимость измерений от температуры пробы (К 1==1, так как температура растворов + 25 С);к - время гидролиэа субстрата, с;Чр - обьем цельной крови, вносимый в пробу.В таблице представлены результаты измерения активности холинэстеразы в цельной крови предлагаемым способом,Устройство для осуществления предлагаемого способа содержит измерительный блок 1, дозатор 2, дифференциатор 3, делитель 4 напряжения, блок 5 памяти, компаратор 6, регистратор 7, блок 8 запуска.Измерительный блок 1 может быть выполнен, например, в виде фотометрической ячейки, содержащей источник света на лампе МН 2,5 В - 0,15 А и фотоприемник на фоторезисторе СФ - 2,5, в качестве разовых кювет используют медицинские флаконы.Дозатор 2 выполнен в виде электрически управляемого автоматического дозатора, например медицинского доэатора Аработающего в режиме разового дозирования.Дифференциатор 3 выполнен по известной схеме на микросхеме с высоким сопротивлением входа, Делитель 4 напряжения, выполненный на двух резисторах, производит деление сигнала с заданным коэффициентом. Блок памяти 5 выполнен на конденсаторе К 73 ПЗ и микросхеме КР 544 УДДА, компаратор 6 - по известной схеме.Трехразрядный регистратор 7 выполнен йо стандартной схеме с цифровым представлением информации. Блок 8 запуска представляет собой коммутационное устройство, выполненное на переключателях П 2 К.Устройство работает следующим образом,Для измерения активности холинэстеразы в крови человека приготовляют реакционную смесь, содержагцую З,О 10М трис-буфера рН 8,0 и 1,2 10 М БАС-С (4,4-Бис-(1-гидро к си-х ло р,6-ди сул ьфо-нафтилазо)дифенилдисульфид динатриевая соль, трехводная). Эту смесь е объеме 5 мл помещают в медицинский флакон, затем в нее вводят 0,05 мл цельной крови человека и перемешивают смесь встряхиванием. Кю вету устанавливают в измерительный блок 1, в реакционную смесь добавляют 5 10М раствор дитиохолинового эфира пробке вой кислоты в объеме 1 мл посредством автоматически управляемого дозатора А,работающего в режиме разового дозирования,5 При нажатии кнопки "Пуск на панелиприбора электрическим импульсом черезблок 8 запуска включается регистратор 7одновременно с дозированием растворасубстрата, Перемешивание реагентов в10 пробе осуществляется барботажем воздухом.В ходе ферментативного гидролизасубстрата образуется тиохолин, вступающий в реакцию с хромогенным красителем15 БАС-Сс образованием окрашенного продукта, Накопление окрашенного продуктавызывает увеличение оптической плотности раствора, что приводит к изменениюсопротивления фоторезистора измери 20 тельного блока 1 и уменьшению напряжения на входе дифференциатора 3, С еговыхода продифференцированный сигналподается на инверсный вход компаратора6 и резистивный делитель 4. С выхода де 25 лителя 4 половинное напряжение сигналапоступает в блок 5 памяти, где это половинное значение запоминается и используется в виде опорного напряжения,подаваемого на второй вход компаратора30 6, В компараторе 6 происходит сравнениетекущего сигнала производной с дифференциатора 3 с опорным сигналом с блока5 памяти,По окончании реакции полного гидро 35 лиза происходит уменьшение текущегосигнала производной и в момент достижения равенства сигнала опорному напряжению на выходе компаратора 6 возникаетсигнал "Стоп", останавливающий регистра 40 тор 7, Время полного гидролиза в секундахсчитывается оператором с регистратора,Точность измерения активности холинэстераэы с помощью предлагаемого способа и устройства повышается примерно в45 десять раэ по сравнению с известным,Формула изобретения1. Способ определения активностихолинэстераэы в крови по изменению оптической плотности реакционной смеси,50 состоящей из пробы цельной крови, тиохолинового субстрата и хромогенного реагента, от л и ч а ю щи й ся тем, что, с цельюупрощения способа и повышения точностиопределения, в качестве субстрата исполь 55 зуют дитиохолиновый эфир пробковой кислоты, а в качестве хромогенного реагентаиспользуют БАС-С 1. (4,4-Бис-(1-гидроксихлор,6-дисульфо-нафтилазо)дифенилди"сульфид динатриевая соль), при этом активность фермента определяют по времени1668949 прекращения изменения оптической плотности реакционной смеси,2. Устройство для определения активности холинэстеразы в крови, содержащее измерительный блок, блок запуска и остановки, регистратор, о т л и ч а ю щ е е с я тем, что, с целью повышения точности определения активности холинэстеразы в крови в него введены дифференциатор, делитель напряжения, блок памяти, компаратор, электрически управляемый дозатор, выход которого соединен жидкостной Среднее квадратическое отклонение дПогрешность измерения активности Ж; Время полного гидролиза суберилдитиохолинаа,с Среднее арифметическое значение А 12,0 0,009 0,448 1,7 0,006 0,327 0,5 0,004 0,352 1,6 0,006 0.360 0,9 0,003 0,307 0,004 0,7 0,499 0,7 0,003 0,374 0,9 0,006 0,634 0,005 0,461 10 0,9 0,006 0,596 134 136 132 185 184 181 172 171 169 167 165 168 196 194 197 120 121 120 160 160 161 95 95 94 131 129 .130 100 101 101 0,448 0,441 0,454 0.324 0,326 0,331 0,349 0,351 0,355 0,359 0,364 0,357 0,306 0,309 0,306 0,500 0,496 0,500 0,375 0,375 0,373 0,632 0,632 0,638 0,458 0,465 0,461 0,600 0,594 0,594 коммуникацией с входом измерительного блока, а вход - с первым выходом блока запуска, выход измерительного блока соединен с входом дифференциатора, выход 5 которого соединен с.первым входом компаратора и входом делителя напряжения, выход которого соединен с входом блока памяти, выход которого соединен с вторым входом компаратора, выход которого 10. соединен с первым входом регистратора,второй вход которого соединен с вторым выходом блока запуска.1668949Составитель Т,Малютинаедактор И,Шуллэ Техред М.Моргентал Корректор М.ДемчикЗаказ 2654 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С 113035, Москва, Ж, Раушская нэб 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина