Способ получения коллагеназы

(51 САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ВТОРС КОМ ИДЕТЕЛЬСТВУ торил бион ти Гепато сапизстатс рительно го отношении последующ нолом. Уде фермента с белка. ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(71) Научно-исследовательская лабордбиологически активных веществ гидротов МЗ СССР и Тихоокеанский инбиооргэнической химии Ддльневостоотделения АН СССР(56) Авторское свидетельство СССРМ 1343591, кл. С 12 К 9/64, 1986. 54) СПОСОБ ПОЛ УЧ Е Н ИЯ КОЛЛ А ГЕ НАЗ Ы Изобретение относится к биотехнолоГии, касается препаративной биохимии и может быть использовано для получения очищенной коллагеназы животного происхождения для применения в клеточной биотехнологии, меховой и кожевенной промышленности, парфюмерии и медицине, в научно-исследовательской работе и является усовершенствованием изобретения по авт.св, К. 1343591.Целью изобретения является повышение удельной активности.Способ заключается в следующем. панкреас крабов Рагайогев а или ЯгосЬег арапса предвдмогенизируют в ацетоне при со:8 - 12 и температуре -15-20 С с ей очисткой ацетоном и н-бутальная активность полученного оставляла 93 - 106 единиц на 1 мг ЬО, 15262(57) Изобретение относится к биотехнологии, касается препдрэтивной биотехнологии и может быть использовано для получения очищенной коллагендзы животного происхождения для применения в клеточной биотехнологии, меховой и кожевенной промышленности, парфюмерии и медицине, Целью изобретения является поьышение удельной активности, Г 1 репарат фермента очищают осаждением сульфатом аммония (50-80;( насыщения) с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-носителе, Причем сорбцию ведут при рН 5-7, а десорбцию - добавлением в буфер 1 моль ИэС 1,Загем проводят осаждение сульфатом аммония (50-807,) с последующей ионообменной хроматографией на носителе, содержащем дизтилдл 1 иноэгильные группировки, а сорбцию проводят при рН 5 - 7, Удег 1 ьндя активность полученной колл агеназы достигает 3500-4000 ед,/1 мг белка против 93- 106 ОЧ ед,/мг по известному способу). МНижняя граница рН обусловлена тем, , что при р 1-ниже 5 наблюдается бцс 1 рдя денатурдция коллагеназы. лэВерхняя граница рН обусловлена гсм, что при рН выше 7 на ионообменникдх сорбируется большое количество балластных г)елков, что резко понижает удельную активность це-,Л левого продукта.Нижняя граница концен грации МН 4)2504 обусловлена тем, что при степени насыщения сульфатом аммонич ниже 50 "г, фермент осаждается неколичественно.Верхняя граница концентрации1526226 насыщения соли выше 80% совместно с коллагеназой соосаждается большое количество балластных белков,Составитель В.ВарламовТехред М.Моргентал Корректор Л,Ливринц Редак 1 ор Заказ 1972 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 П р и м е р 1, 3 г коллагеназы краба с активностьО 100 ед./мг белка растворяют в 50 мл 0,2 М фосфатного буфера, рН 7,9, при комнатной температуре и центрифугируют при 300009 в течение 30 мин. Полученный осадок повторно растворяют в 35 мл того же буфера. Затем супернатанты обьединяют. К полученному раствору коллагеназы при 4 С добавляОт (ИН 42504 до 607, от насыщения и инкубируют в течение 1 ч, Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, а зател 1 растворяю в 10 мл 20 мм ацетатного буфера, рН 5, и дважды диализуют против того же буфера. Раствор коллагеназы наносят на колонку с ДЭАЭ-сефарозой С 6 В РЬаггпаса (9180 мм), уравновешенной 20 мМ ацетатным буфером, рН 5, Фермент элюируют тем же буфером. содержащим 1 моль МаС. Фракции, содержащие коллагенаэную активность, обьединяют, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы краба равна 4000 ед./мг белка,П р и м е р 2. Очистку коллагеназы проводят аналогично примеру 1, однако осаждение фермента проводят 50 -ным по5 насыщению(МН 4)2501, а при ионообменнойхроматографии используОт ДЭАЭ-сферон"С 1 егпаро", уравновешенный 50 мМ трисНС 1, рН 7. Удельная активность полученногопрепарата коллагеназы 3890 ед,/мг белка,10 П р и м е р 3, Очистку коллагеназы проводят аналогично примеру 1, однако осаждение фермента проводят 80%-ным понасыщению(МН 4)2501, а при ионообменнойхроматографии используют ДЭАЭ-сферо 15 нит ВНИИ особо чистьх веществ, уравновешенный 20 мМ ацетагным буфером, рН 5,Удельная активность полученного препарата коллагеназы 3500 ед./мг белка.Формула изобретения20 Способ получения коллагеназы по эвт,св.%1343591, отл ич а ю щи йс ятем, что, сцелью повышения удельной активности, очистку препарата проводят осаждением 50000 -ным по насыщению сульфатом аммонияс последующей ионообменной хроматографией на ДЭЛЭ-носителе, причем сорбцию ведут в буфере при рН 5-7, а десорбцию тем жебуфером, содержащим 1 моль МаС,