Способ получения гиалуронидазы

(61) Дополнительное к авт. сви 2) Заяв 1.04.77 (21) 2471215/23-04 (51) Ст 7/О Яе прнсое ением заяв Гаоударстеенный комитет Совета Министров СССР по делам изооретений н открытий) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИ ОНИ ДАЗЬ обретени рментных собу полу . 1, 35)-ф зм глико н к таб организме, Этот применение в жи зяйстве, кожевен ности, а также в ной практике. Гнал ержится во многих ивогных. Наиболее и гиалуронидазы жи я являются тестику уронидаза соджидкостях жи источникампроисхождениерма 111 . Ивыделения гупного рогатоввны нв том квн огатым во тн ого лы вестно нес ивлуронида го скота что зксгр среде (ра ее смесь ьк способо тикул к они осн ы из тес 1 . Все кцию тказбввленнвяразбввни проводят в уксусная. кисло ленной соляной фрвкционирован органическими нл кислоием су едуюшим мония ил г растворите хрома гоносится к способу полупрепаратов, в частносчения гиалуронидазыермента, регулируюшегозамингликанов в живомфермент находит широкоеотноводстве, рыбном хоо-меховой промышленмедицине и в лаборатор 2Известен, в частности, способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота 12, Способ заключается в следующем: все операции ведут приоО - 5 С. Замороженные сухим льдом тка ни тестикул гомогенизируют в равном количестве воды, К суспензии добавляют ледяную уксусную кислоту до рН 4,0. Ооотввляют при температуре 4 - 5 С на 15 ч.Цен трифугируют. Осадок реэкстрвгируют о водой. Недосвдочные фракции обьединяют.фильтруют, Иоводят рН до 4,5. добавляют сульфат аммония до 10-12%-ного насыщения. Осадок удаляют центрифугированием. Иалее добавляют сульфат аммония 5 до 30-40%-ного насыщения. Белок, содержащий ферменгвтивную активность, сбирвюг ценгрифугированием и диализуютпротив холодной проточной воды в течение 27 ч. Огдиалнзованный раствор лио- О филизуюг.Выход 2,5 г из 1 кг исходного материала, Активность 54,5 МЕ/мг.Однако этот способ получения гивлуронидвзы имеет ряд недостатков. Твк, фермент получают с низким выходом (2,5 г" из 1 кг сырья), так как в качестве исходного сырья используют семенники крупного рогатого скота, из которых получают малоконцентрированные экстракты; причемимеются потери фермента в процессе экстракции, где при рН 4,0 часть ферментаосаждается вместе с баластными веществами, Часть фермента теряется при осаждении сульфатом аммония 10-12%-ного 16 насыщения. Часть активности теряется в процессе фильтровании.Кроме того, полученный препарат фермента характеризуется сравнительно низкой активностью (54,5 МЕ/мг). 13Белью изобретения является повышениеактивности и выхода целевого продукта,Указанная цель достигается за счет того, что в качестве исходного . сырья испол зуют сперму крупного рогатого скота, заб-Я ракованную для искусственного осеменения,акстракцию проводят не кислым буфером,и раствором хлористого натрия при рН5,8 - 6,3, поскольку, начиная с рН 56 и ниже, наблюдается выпадение осадка, в 2который вовлекается часть фермента, чтоприводит к значительной его потере. фракционирование сульфатом аммония проводятв два этапа, причем 1-ое фракционирование ведут 60-65%-ным насыщением сульфата аммония, 2-ое фракционирование проводят на стадии после диализа последовательным добавлением сульфата аммония, до38-45%-ного насыщения и 65-70%-ногонасыщения и конечный продукт выделяют 3известным способом.Из спермы можно получить концентрированные экстракты без дополнительнойобработки сырья, Зто позволяет выделитьфермент с минимальными потерями активности.На первом этапе осаждения 60-65%-ного насыщения сульфатом аммония получают фракцию, содержащую практически весь фермент,.содержащийся в экстракте и низ- ф комолекулярные примеси, Зтв операция позволяет сохранить всю активность фермента без потерь. При помощи диализа освобождаются от ионов сульфата и аммония и части низкомолекулярных примесей.После диализа - насыщением диализатв до 38-45% сульфатом аммония-полностью отделяют все балвстные белки. Ловедением до насыщения сульфата аммониядо 65-70% осаждают гиалуронидазу,ОФрвкционирование в три этапа позволя-ет выделить весь фермент с высоким выходом и активностью. Согласно изобретению описывается способ получения гиалуронидазы с высоким выходом и удельной активностью посредством экстракции раствором хлористого натрия с рН 5,8-6,3 спермы крупного рогатого скота, забракованной для искусственного осеменения, затем экстракт подвергают фракционироввнию сульфатом аммония, причем 1-ое фракционирование проводят 60-65% ным насыщением сульфата аммония, 2-ое фракционирование проводят нв стадии после диализа последовательным добавлением сульфата аммония до 38-45%- ного насыщения и 65-70%-ного насыщения и конечный продукт выделяют известным способом.Предпочтительно процесс выделения про- водят следующим образом:Сперму оттаивают, разбавляют в пять раз 0,15 М раствором хлористого натрия в дистиллированной воде; рН смеси 5,8- 6.3. Смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при температуре 4-5 С, центрифугируют, добавляют сульфат аммония до 60-65 оо-ного насыщения. Оставляютопри температуре 4-5 С в течение 4 ч.Бентрифугируют, Осадок растворяют в дистиллированной воде, диализуют в течение 24 ч против проточной дистиллированной воды. При выпадении осадка в диализатецентрифугируют. Нобавляют сульфат аммония до 38-45%-ного насыщения. Оставляют при температуре 4-5 С в течение 2 ч, цен трифугируют. В нвдосадочную жидкость добавляют сульфат аммония до 65-70%-ного насыщения.оОставляют при температуре 4-5 С в течение 10 ч, Бентрифугируют. Осадок растворяют в дистиллированной воде. Иивлизуют 24 ч против проточной дистиллированной воды. При выпадении осадка в дивлизате - центрифугируют. Нивлизат лиофилизуют.Пример получения гиалуронидазы. К 100 мл оттаенной спермы добавляют 400 мл 0,15 М раствора хлористого натрия в дистиллированной воде. Устанавливают рН 6,0. Смесь медленно перемешиовают при температуре 4-5 С в течение 4 ч. Центрифугируют. Прибавляют 195 г (60%) сульфата аммония, Оставляют приотемпературе 4-5 С в течение 4 ч. Цен. рифугируют. Осадок растворяют в 70 мл дистиллированной воды. 0 иализуют в течение 24 ч против проточной дистиллированной воды. Удаляют выпавший осадок центрифугированием.