Способ получения двух молекулярных форм карбоангидразы

"гФ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОРМ КАРБОАНГИДРАЗЫ(57) Изобретение относится к технике производства очищенных Ферментных препаратов. Цель изобретения - повышение выхода, а также упрощение и ускорение процесса. Способ заключается в том, что для получения экстракта, обладающего карбоангидразной активностью, из гомогенизированных листьев бобов гомогенат подкисляют до рН 6,0-6,5 с последующим растворением белков, осажденныхсульфатом аммония, в цитратно-фосФатном буфере с рН 4,5-5,5, проведением гель-фильтрации на сефарозе6 В при рН 6,5-7,0, разделением иочисткой форм 1 и 2 карбоангидразыметодом ноно-обменной хроматографиина ДЕАЕ-целлюлозе, при этом колонкупромывают триссульфатным буфером срН 8,0-8,5, содержащим 20-40 мМсульфата натрия, затем элюируют последовательно карбоангидразу 1 икарбоангидразу 2 триссульфатным буФером, содержащим сначала 60 - 70 мМ,затем 40-50 мМ сульфата натрия срН 8,0 - 8,5 и 5,5 - 6,5 соответственно.Способ позволяет получить две высокоочищенные формы карбоангидразы,повысить в 2 раза их активность,увеличить в 4 раза выход целевыхпродуктов и обеспечить высокую стабильность Ферментов при хранении.1 табл, 4 ил.Изобретение относится к биохимии,а именно к технике производстваочищенных ферментных препаратов язрастений, в частности к получениюкарбоангидразы, и может быть использовано в научных исследованиях различных направлений биохимии, биотехнологии, генетики, а также в медицине для фя-;иологических исследований,Карбоангядраза (КФ 4.2,1.1, карбонатгидролиаза - КА) представляетсобой фермент, катализирующий обратимую реакцию гидратации двуокисиуглерода, Этот фермент широко распространен в растительном мире иимеет значение для самых разнообразных процессов жизнедеятельностиклетки. Карбоангядраза - высокочувствительный фермент, остро реагирующий на дефицит цинка при минеральномпитания растений животных и человека и используется как диагностическийтест болезней, связанных с цинковойнедостаточностью,Цель изобретения - повышение выхода, активности и стабильности прихранении целевых продуктов упрощение и ускорение процесса,Способ осуществляют следующим образом.Б качестве источника сырья используют литья бобов сорта "Черные русские , обладающие повышенным содержанием КА 187. от общего белка листьев бобов) .После осуществления гомогенизации листьев бобов производят подкисление гомогспата путем прибавления 0,1 н. Н 50 по каплям рн 6,0-6,5 с последующим его центрифугированясм для получения суперпатанта-экстракта, обладающего КА-активностью, и отделсния от осажденных балластных белков . Зто позволяет полнее извлечь целевыепродукты, лучше отделить их от примесных белков, Подкисление гомогената до рН меньше б приводят к уменьшению количества. балластного белка в супернатанте, однако при этом наблюдается значительная инактивация обеих форм КА, особенно формы 1. Пря увеличении рН более 6,5 увеличивается количество примесного белка, перешедшего в экстракт (пря рН 8,0 белка в экстракте в 2 раза больше, чем при рН 6,01, что снижает качество последующего от.",.еления форм 1 и 2 от этого белка.10 15 20 25 30 35 40 45 50 Белки экстракта, обладающие КА-активностью, высаливают сернокислымаммонием в узком интервале концентраций 40 в 5). Осадок белков, полученный при 402-ном насыщении, не имеющий КА-активности, отбрасывают, Собирают осадок белков, полученный при557.-ном насыщении сульфатом аммония.При расширении интервала фракционирования до 30-607. происходит сильноезагрязнение КА-фракции примесным белком,Осадок белков, полученный высаливанием сернокислым аммонием и содержащий карбоангидразу, перед проведением гель-фильтрации растворяют в минимальном обьеме цитратно-фосфатногобуфера с рН 4,5-5,5. Карбоангидразапереходит в супернатант при последующем центрифугировании (20000 ц, 20мин), а нерастворившийся белок, необладающий КА-активностью, отбрасывают, При увеличении значения рНиз осадка в раствор переходит большее количество примесного белка,что существенно ухудшает эффективность выделения я очистки КА наэтой стадии. При уменьшении значения рН происходит резкое снижениевыхода КА в растворимую фракцию.Гель-фильтрацию проводят на колонке размером 2,5 70 см, заполненную сефарозой 6 Б; белки элюируютфосфатным буфером с рН 6,5-7,0,Такое проведение гель-Фильтрацииувеличивает скорость элюации и ускоряет процесс выделения форм 1 и 2на этой стадии по сравнению с прототипом в 2 раза. Указанные значениярН буфера являются оптимальными,поскольку обеспечивают стабильноесостояние обоих форм КА при проведении гель-фильтрации, Уменьшениеили увеличение значения рН приводитк соответствующему снижению стабильности формы 1 либо формы 2 КА врастворе, вплоть до полного ясчезновения активности за время осущест -вленяя гель в фильтрац (5 ч), я кготере этих ферментов в ходе последующего выделения и очистки другимиметодами. Полученную после гель-фильтрации карбоангидразную фракцию подвергают яонообменной хроматографии на ДЕАЕ- целлюлозе, которую проводят на колонке размером 3 16 см, обеспечиваю45 щей хорошую скорость элюации и позволяюцей весь процесс разделенияформ КА провести за 4-5 ч вместо72 ч, необходимых для проведения5изоэлектрического фокусирования,т.е, уменьшающей временные затратына осуществление этой стадии, Использование 0,01 М триссульфатного буфера рН 8,0-8,5, содержащего 20 ммсульфата натрия в качестве уравновешивающего буфера, обеспечивает оптимальную сорбцию исходной КА и полноесвязывание с ДЕАЕ в целлюлоз, Припоследующем промывании ДЕАЕ-целлюлозы указанным буфером КА-активностьв элюате не обнаруживается. Использование рН уравновешивающего буфераниже значений 8,0 ведет к неполнойадсорбции форм 1 и 2 КА на ДЕАЕ в цлюлозе, к частичной десорбции КА иобнаружению ее активности в элюате.При значениях рН выше 8,5 КА-актив -ность в элюате не обнаруживается,формыи 2 связываются ДЕАЕ-целлюлозой полностью, однако промываниеэтими растворами инактивирует Форму 2.Картину элюирования Форм 1 и 2КА, помимо рН, определяет также ионная сила буфера, которая создаетсядобавлением сульфата натрия в буферный раствор, При значениях рН буфера8,0 - 8,5 и концентрациях сульфатанатрия 60-70 мМ с ДЕАЕ-целлюлозы35элюируется только Форма 1. При концентрациях сульфата натрия в буферес рН 8,0-8,5, меньших 60-70 мМ,КА-активность в элюате не обнаруживается, а при больших концентрацияхнаблюдается частичная инактизацияформ 1 и 2. Получение Формы 2 в этихусловиях нежелательно вследствие еесильной инактиацли в растворе с рН80-8,5, Оптимальную десорбцию формы 2 с ДЕАЕ-целлюлозы осуществляют0,01 М питратно - Фосфатным буфером,рН 5,5-6,5, содержащим 40-50 мМсульфата натрия, Перед снятием Формы 2 этим раствором колонку сДЕАЕ-целлюлозой тщательно освобождают от Формы 1 и постороннего белкавначале вышеуказанным промыванием0,0 М триссульфатным буфером,рН 8,0-8,5, содержащим 60-70 мМсульфата натрия (500 мл), затемраствором 0,01 М цитратно-Фосфатногобуфера, рН 4,5 - 5,5 (500 мл), содер -жащ.м 40-50 мМ сульфата натрия. Во всех случаях промывание колонки продолжают до полного исчезновения белка в элюате, что контролирует по измерению поглощения при 280 нм.П р и и е р 1, Объектом служат листья бобов сорта "Черные русские". Растения выращивают в деревянных ящиках с почвой.Стадия 1. 300 г свежеотобранных листьев (28-дневных) фиксируют жидким азотом и растирают в Фарфоровой ступке с 300 мл 0,1 М триссульфатногс буфера, рН 7,8, содержащего 0,1 М МЭ и 0,002 ЭДТА, Растертую массу медленно размораживают путем насстаивания при 4 С в течение 5 ч при гериодическом перемешивании, Полученный гомогепат при непрерывном перемешивании подкисляют до рН 6,3 прибавлением по каплям 0,1 н Н 80 и тотчас фильтруют через двойной слой капрона, Фильтрат центрифугируют при 22000 д в течение 20 мин. Недостаточная жидкость содержащая 1380 мг белка, - экстракт листьев.Стадия 2, Б экстракт добавляют твердый сульфат аммония до 403-ного насыщения. Осадок белков, полученный при этом насыщении, отделяют центрифурированием при 10000 д, 20 мин и отбрасываютК супернатанту добавляют сульфат аммония до 557.-ного насыщения. Осадок, обладающий КА-активностью, собирают центрифугированием (1 С 0009, 20 мин) и растворяют в минимальном объеме (5-10 мл) 0,01 М цитратно-фосфаного буФера, рН 5,0, содержашего 0,05 М МЭ, при перемешивании. Нерастворившийся белок, не обладаюший КА-активностью, отделяют пентрифугированием при 20000 п, 20 мин.Стадия 3. Полученный супернатант наносят на стеклянную хроматографическую колонку (размером 2,5 70 см), заполненную сефарсзой 6 В, уравновешенную фосфатным буфером, рН 6,8, ссдержашим 0,05 М МЭ, После выхода 100 мл пустого объема сбор фракций пс 5 мл осуществляют на коллекторе Фракций со скоростью 2 мл/мин. Типичная картина гель-фильтрации на сефарозе оБ показана на фиг,1.Во Фракциях промеряют белок по поглощению при 280 нм и активность КА колсриметрическим методом, Наиболее активные фракции с объемами вы 1359298хода 120 210 мл объединяют; полученный объем составляет 90 мл,Стадия 4. Ферментный раствор наслаивают на колонку (размером3.16 см) с ДЕАЕ-целлюлозой (номинальная емкость 0,60-0,80 мэкв/г,Фактор набухаемости 9,0 мл/г сухогоанионита, фирма "Реанал", Венгрия),уравновешенную 0,01 М триссульфатным 10буФером, рН 8,2, содержащим 0,05 ММЭ и 20 мМ сульфата натрия (200 мл).Неадсорбированный белок вымывают темже раствором, получая элюат, не обладающий КА-активностью, который 15отбрасывают. Фракционирование белковс ДЕАЕ-целлюлозы проводят в 2 этапа.Первоначально колонку промывают растворами 40 мМ для промывки (200 мл,фракция 1) и 60 мМ (фракция 11, 20200 мл) сульфата натрия в 0,01 Мтриссульфатном буфере, рН 8,2. Затембелки с ДЕАЕ-целлюлозы элюируют растворами 20 мМ для промывки (200 мл,фракция 111) и 40 мМ 200 мл, фракция 1 У) сульфата натрия в 0,01 М цитратно-Фосфатном буфере, рН 5,8.Промывание растворами во всех случаяхпродолжают до полного исчезновенияпоглощения белка в элюате при 280 нм. 30Фракции 1 и 111, не обладающие КАактивностью, отбрасывают. АктивностьКА обнаруживается во фракциях 11 и 1 У.Сбор фракций О мл осуществляют наколлекторе Фракций со скоростью10 мл/мин.фиг,2 отражает типичную картинуэлюации.Во Фракциях промеряют белок попоглощению при 280 нм и активность 40КА, Наиболее активные Фракции с объемами выхода 50-150 мл объединяют,.Первая активная Фракция 11 соответствует Форме 1, содержит94 мг белка и имеет удельную 45активность 20500 Е/мг белка. Вторая активная фракция 1 является Формой 2, Содержит 12 мг белкаи имеет удельную активность9700 Е/мг белка.50 Стадия 5, Полученные Ферментные растворы Форм 1 и 2 КА раздельно концентрируют сульфатом аммония при 70 -ном насыщении, центрифугируют при 220009, 20 мин и хранят в виде осадков под сульфатом аммонияопри - 20 С, Активность Формы 1 сохраняется в течение 6 мес без изменения, а формы 2 - 1 мес в этих условиях.Полученные препараты Форм 1 и 2 гомогенны: при исследовании в аналитической центрифуге 5 р 1 псо, модель Е (США), каждый фермент показывает единственный пик (Фиг.3) с коэффициентами седиментации 15,8 5 и 16,0 5 соответственно для форм 1 и 2 (скорость вращения ротора 48660 об/мин, съемка сделана после 16 мин достиже- ния равновесия при концентрации белка 3,5 мг/мл). При аналитическом диск-электрофорезе в 7,5 полиакриламидном геле каждая Форма мигрирует в виде одной белковой полосы (фиг,4).Результаты очистки и выделения Форм 1 и 2 КА из листьев бобов приведены в таблице, где для сравнения даны также результаты очистки по известному способу. Результаты, приведенные в таблице, показывают, что предлагаемый способ по сравнению с известным позво - ляет повысить активность гомогенных форм 1 и 2 КА в 2 раза и выход в 4 раза (вот общего белка листьев),П р и м е р 2. Способ осуществляют как в примере 1. После гомогенизации листьев бобов гомогенат подкисляют до рН 6,5, центрифугируют. Экстракт, содержащий 1600 мг белка с удельной активностью 585 Б/мг белка, высаливают сульфатом аммония в интервале 40-55% и садок растворяют в 5 мл 0,01 М цитратно-фосфатного буфера, рН 55, Полученный супернатант с удельной активностью КА 800 Е/мг белка, содержащий 350 мг белка, подвергают гель-фильтрации на сефарозе 6 В 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,0. КА-фракцию, имеющую удельную активность 4000 Е/мг белка (180 мг белка), хроматографируют на ДЕАЕ-целлюлозе, элюируя вначале Форму 1 растворами 30 мМ (для промывки) и 70 мМ сульфата натрия в 0,01 М триссульфатном буфере, рН 8,5, затем Форму 2 - растворами 30 мМ и 50 мМ сульфата натрия в 0,01 М цитратно-Фосфатном буфере, рН 6,5, Формы 1 и 2 получают гомогенными с выходом 7 и О,б ., степенью очистки 22 и 1 О рб, удельной активностью 22000 и "9500 Е/мг белка соответственно. Показателитакже значительно выше, чем по известному способу,1359298 Известныи способ Получение экстракта из листьевбобов 100 1,0 246 2800 фракционированиесульфатом аммония 33 3,0 981 933 П р и м е р 3. Способ осуществляют как в примере 1, Однако гомогенат подкисляют до рН 6,0, осадок белков, высаливаемых сульфатом аммония, растворяют в 0,01 М цитратно-Фосфатном буфере с рН 4,5, гель- Фильтрацию на сефарозе 6 В проводят при рН 6,5. Последующее разделение форм 1 и 2 КА методом ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе ведут растворами 20 мМ (для промывки) и 60 мМ сульфата натрия в 0,01 М триссульфатном буфере, рН 8,0 и раствором 40 мМ сульфата натрия в 0,01 М цитратно-фосфатном буфере, рН 5,5. Формы 1 и 2 КА выделяются по этому способу с показателями (удельной активностью, выходу, гомогенности, степени очистки, стабильности), аналогичными примеру 1. Таким образом, использование предлагаемого способа получения форм 1 и 2 карбоангидразы из растений упрощает технологию получения целевых продуктов и ускоряет процесс выделения ферментов в 15 раз за счет применения ионообмен.1 ой хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе вместо изоэлектрического фокусирования, позволяет получить высокоочищенные ферменты за счет подбора оптимальных условий выделения и очистки карбоангидразы на стадиях гомогенизации, гель- фильтрации, ионообменной хроматограФии, повысить их активность в 2 раза, выход в 4 раза и стабильностьпри хранении. Формула изобретения Способ получения двух молекулярных форм карбоангидразы, предусматривающий гомогенизаций наземной 10 части растений в буферном растворе, отделение твердой фазы изгомогената, осаждение белков изполученного экстракта сульфатомаммония при насыщении 40-557., растворение осадка и его гель-Фильтрацию с последующим разделением двухформ фарбоангидразы, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения выхода, активности и стабильности при хранении целевых продуктов,упрощения и ускорения процесса, гомогенат подкисляют до рН 6,0-6,5,растворение осадка осуществляютцитратно-фосфатным буфером с рН 25 4,5-5,5, гель-фильтрацию проводятна сефарозе 6 В Фосфатным буфером срН 6,5-7,0 с последующим разделениеми очисткой целевых продуктов ионообменной хроматографией на колонке с 30 ДЕАЕ-целлюлозой, при этом колонкупромывают триссульфатным буфером срН 8,0 - 8,5, содержащим 20-40 мМсульфата натрия, затем элюируюткарбоангидразу 1 и карбоангидразу Птриссульфатным буфером, содержащимсначала 60 - 70 мМ, затем 40-50 мМсульфата натрия с рН 8,0-8,5 и 5,56,5 соответственно.10 1359298 8,1 17,5 4300 250 1,4 11000 44,8 40 Фракция сФормой 2 0,2 5000 20,3 Предлагаемый способ Получение экстрактаиз листьев бобов 1380 450 100 1,0 Фракционированиесульфатом аммония 306 22,2 1,7 784 3496 10,1 7,7 150 6,9 20500 45,5 фракция сформой 2 0,8 21,5 9700 12 и ю гао гго мФракиаа,юл 700 1 Л Щ Гель-фильтрацияна сефадексе6-200 Изоэлектрическоефокусирование:фракция сформой 1 Гель-фильтрация на,сефарозе 6 В Ионнообменная хроматография на ЦЕЛЕ-целлюлозе:Фракция с формой 1 Продолжение таблицы1359298 ФврмаСоставитель Е,ВоробьеваТехред Л.Сердюкова Корректор И,Эрдейи Редактор И.Рыбченко Заказ б 115/2 б Тираж 500 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5