Способ получения -амилазы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК И 9) (И) б 9 С ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И.ОТКРЫТ ИЙИЗОБРЕТ ЕТЕЛЬСТВУ(56) 1, Авторское свидетельство СССРпо заявке М 2588998/13,кл, С 12 В 13/10, 1978.2. Авторское свидетельство СССРР 538024, кл. С 12 Р 13/10., 1975.(54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯО(, -АМИЛАЗЫ, предусматривающий культирование продуцента Вас 111 цв вцЬФ 111 вв аэробных условиях на ферментационной питательной среде, содержащей. источники углерода - крахмал и лактозу, источник азота и фосфора - (БН 4) НР 04, ростОвые факторы - бе ново-витаминный концентрат и куку ный.экстракт, минеральные соли На СаСО, К 804, МдБ 047 Н О, СцЯ 04 иводу, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и его стабильности в качестве продуцента используют штамм Васх 11 цв вцЬС 111 в ВНИИгенетика.2. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что в состав питательной среды дополнительно вводят, Ъ от ее объема, минеральные солиф СаС 1 у 0,08-0,15, ГеС 1 бНО 0,005-0,02, 2 п 804 0,001-0,003, а количество крахмала устанавливают равным 16-24, (БН 4) Н Р 04 0,9-2,0 НаС 1 0,08-0,3лрузС 1,ОПИСАН И АВТОРСКОМУ 9 2.8 // С 12 Н 15 0841351 Изобретение относитоя к,микробиологической промышленности, а именно к способам получения 0 -амилазы.Препараты, содержащие М -айилазу,используются в животноводстве, пищевой, текстильной,. бумажной промышленности и других областях народного хозяйства.,Известен способ получения амилолитических ферментных препаратов с испольэованнем штамма Вас 111 цв вцЬС 111 з 10"ВНИИгенетика" выращиванием посевного материала на ломтиках картофеля с последующей Ферментацией, в условиях аэрации на среде, содержащейкрахмал, кукурузный экстракт, нитрат 15аммония и мел. Штамм Вас 111 ця вцЬ 11 -11 я ВНИИгенетикав лабораторныхусловиях в колбах имеет активность360-450 ед/мл за 48 ч Ферментации 1.Однако штамм Вас 11 цв вцЬ 11 я 20ВНИИгенетикане дает оптимальновысоких активностей в производственных условиях в Ферментерах емкостью20 м . Кроме того, Ферментационная9среда, испбльзуемая для такого штамма, на производстве не позволяетполучать стабильный препарат,.Известен способ получения 0 -амилазы, предусматривающий культивирование продуцента Вас 11 цз зцЬ 1111 з0-43 в аэробных условиях на ферментационной питательнойсреде, содержащей,источники углерода - крахмали лактоэу, источник азота и Фосфооа - (НН)НРЙ 4, ростовые Факторыбелково-Витаминный концентрат и кукурузный экстракт, минеральные солиБаС 1, СаСО, КуБО 4, МББО 4 "7 Н,20,СиБО 4 и воду 2.Амияолитическая активность культуральной жидкости, полученной в 40лабораторных условиях, в колбах составляет 303 ед/мл. В промышленныхусловиях этот штамм при культивироЛмилолитическая активность, ед/мл Номер Ферментации309 233 301 226 302 208 Средняя амилолитическая активность по трем Фермента- циям 304 222 чен,в результате применения генетино-селекционных методов и в промышленных условиях является более продуктивным, чем прототип - штамм Вас 111 ця я 1 Ь 1111 я ЗНИИгенетика. 3Штамм Вао 111 цв вцу 111 я ВНИИгенетикаявляется мутантом исходного штамма Вас 111 цз вцьФв 11 з В) полученного из Музея живых культур ,института "ВНИИгенетика". Штам позу ванин на ферментерах по сравнению со штаммом Вас 111 ця вцЬ 111 в ВНИИ- генетикане проявляет вышеотмеченной активности.В связи с тем, что штамм Васд 11 цв яцЬ 1111 я ВНИИгенетикав производственных условиях является более,активным продуцентом, сопоставительный анализ активностей проводят с учетом этого Факта.Целью изобретения является ловышенне выхода целевого продукта и его стабильности.Поставленная цель достигается тем что в качестве продуцента используют штамм Вас 111 цв яцЬ 111 в ВНИИгенетика, в состав питательной среды дополнительно вводят, Ъ от ее объема, минерЪльные соли: СаС 1 д 0,08-0,15, РеС 1 фбНО 0,005- 0,02, .2 пБО 4 0,001-0,003, а количество крахмала устанавливаютоавным 16-24, (ИН 4) НРО 4 0,9-2,0 ю НаС 1 0,08-0,3Сущность спосОба состоит в том, что в условиях производства на Ферментационной питательной среде нового состава, содержащей крахмал, лактозу, кукурузный Экмтракт, амилолитическая активность штамма Вас 111 ия яиЬ 1111 в ВНИИгенетикана 15 выше, чем у штамма Вас 111 ця яцЬ 111 я ВНИИгенетика. Так, активность ппамма ВНИК-генетикав этих усло виух через 64 ч ферментации достигает 309 ед/мл, в то время как активность штамма ВНИИгенетика- 232 ед/мл.В таблице приведены сравнительные данные трех параллельных ферментаций с использованием штаммов Вас 11 ця вцЬй 111 в ВНИИгенетикаи ВНИИгенетикав производственных условиях в Ферментерах емкостью 20 м 9. Продолжительность Ферментации 60-64 ч.Ниже приведена биологическаяхарактеристика штамма Вас 111 цвяцЬС 111 в ВНИИгенетика.Культурально-морфологическиепризнаки ппамма Вас 111 ця в 1 ЬС 111 вВНИИгенетика.Морфология. Штам представляет собой грамположительную, спопообразующую палочку, размером 2,5-4,5 хх 0,5-0,7(й . Размер спор: 1,0-1,.2 хх 0,6"0,7 р .10Культуральные и Физиологическиепризнаки.Мясо-пептонный агар (МПА). Через48 ч инкубации при 370 С образует. желторато-сеерые плоские, круглые, 15колонии, диаметром 2,5-3,5 мм и слопастными краями: колонии не врастают в агар, Поверхность гладкая,матовая,Посев штрихом на мясо-пептонном 20агаре, При инкубации в течение 24 чпри 37 С рост хороший. Штрих нитеОвидный с лопастным краем и гладкой,матовой поверхностью.Посев уколом. Рост на поверхности.25Культура аэробная.Мясо-пептонный бульон (МПБ) Приинкубации в течение 24 ч при 37 Сбез встряхивания рост беэ помутнениясреды, на поверхности образуетсясухая пленка. При встряхивании накачалке - сильное помутнение среды.При стоянии образуется пленка.Агаризованная среда Хоттингера.При инкубации в течение 48 ч при37 ОС образует желтовато-серые, круглые, плоские колонии с белым лопаст"ным краем, диаметром 3,5-5 мм. Поверхность шероховатая, матовая. Насинтетической среде с минеральнымазотом (среза Спицайзена) растет в 40виде мелких круглых колоний диаметром 1-2 мм серовато-белого цвета.Поверхность матовая. Колонии срастаются с,субстратом.На ломтиках картофеля пигмента 45не образует, имеет матовую, сухую,морщинистую поверхность.Желатину разжижает на вторые сутКиеКрахмал гидролиэует, 50Молоко пептонизирует и подщелачивает.Отношение к источникам углерода.Глюкозу, лактозу, фруктоэу, сахарову ассимилирует 55Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии в стеклянных ампулах.В отличие от прототипа, обладающе.го сниженной активностью щелочнойпротеинаеы, штамм Вас 11 цв вЬС 111 яВНИИгенетикаимеет нормальный уро.вень синтеза щелочной протеиназы,Штамм Вас 111 ця виЬС 11 в ВНИИгенетикахранится в Музее живых культур института "ВНИИгенетика" подрегистрационным номером ЦМПМ В.Штамм Вас 111 цв вцЬС 11 в ВНИИгенетикавыращивают поверхностнымспособом в колбах в виде пленки нажидкой питательной среде, содержащей следующие компоненты крахмал,(НН 4)У СБН 60 У, КНУР 04, МАМБО7 Н 20,СвЯ 04, РеБ 04, МпЯ 04, СцБ 04, и-аминобензойная кислота,. вода рй среды6,0-6,3: Полученнйм таким образомпосевным материалом в количестве0,01-0,02 от объема ферментационной среды засевают аппарат емкостью20 м , содержащий 10 м ферментационной питательной среды состава, :крахмал 16-24, лактоза 0,2-0,3,кукурузный экстракт 0,8-1,2,. БВК0,2-0,4, (БН 4)2 НР 04 0,9-2 ро, НаС 10,08-0,3., СаС 1 д 0,08-0,15, СаС 09О,О 2-О,О 3, МЯЯО 4.7 Н О О,О 5-О,25,КдБО 4 0,02-0,09, РеС 1бндО 0,050,02, ЕпЯ 04 0,001-0,003, СцБ 040,00025-0,00040, МпБ 04 0,0001-0,0002,вода,72,2-81,7.Содержание крахмала в ферментационной питательной среде 8-10,остальное количество крахмала добавляют в виде подпитки в Ферментерво время культивированияСогласно предлагаемому способуне проводят полного гидролиза крахмала, входящего в состав. ферментационной среды (в том числе и добавляемого в виде,под итки). Достаточно провести разжижение крахмала,т.е, осуществить его неполный гидролиз только до амилодекстринов (синяяокраска при реакции с йодом). В про"изводстве по лицензии, приобретенной Советским Союзом (Главмикробиопром) у французской фирпы 1 Рапидаз",в составе ферментационной среды используют глубоко осахаренный крахмал, получаемый после полного гидролиза его до декстринов (бурая окраска при реакции с йодом).ФП р и м е р 1Посевной материалполучают выращиванием штамма Вас 111 цввцдС 111 в ВНИИгенетикав колбахв виде пленки в жидкой питательнойсреде состава, : крахмал 10,(НН 4)д СКто 3, Мвн Р 04 0,03,МАМБО "7 нд 0 0,15, кнуР 04 0,2,СаЯОс 0,15., РеЯ 04 0;002, МпБ 040,000125, СцЯ 04 0,00075, п-аминобензойная кислота 0,001, вода 86,2,рн 6,0-6,3, температура 35-3 баС.Полученньй посевной материал вколичестве 0,01 от объема среды вФерментере вносят в аппарат объемом20 м 9, содержащий 10 м 9 ферментационной среды состава, : крахмал 24841351 Составитель И. Приваловаредактор 3. Бородина Техред Т. Маточка,Корректор :О. Тигор Заказ 10852/3 Тираж 523ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Подписное Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 аС 1 0,08, СаС 1 0,08, СаСО 4 0,02,я 004780 0,07 куя 04 0,02,ГеС 1 бН 0 0,005, 2 пБО 0,001,Сц 804 0,00035, Мпоо 4 0,0002, вода73,3. рН 6,5. Пеногаситель 0,05.Процесс Ферментации ведут при37 фС с аэрацией в течение 64 ч.Культуральную жидкость, имевщувактивность 309 ед/мл Ы -,амилазы,высушивают на распылительной сушилке. Выход готового продукта 73.Н р и м е р2. Штапель-продуцент,приготовление посевного материалате же, что в примере 1. Отличие состоит в составе Ферментационной среды и температуре культивирования.Культивирование проводят в Ферментере объемом 20 м, заполненном 10 мФерментационной питательной средыследующего состава, : крахмал 16(в среду вносят 10, остальное добавлявт в виде подпитки в ходе ферментации), лактоза 0,3, кукурузный экстракт 1,1, БВК 0,4, (Н 4)Н РО 4 1,7,МаС 1 0,2, СаС 11 0,12, СаС 03 0,03,МКБ 04 7 н 0 О;2 к 50 09Рес 1 фбно 250,015, 2 пБО 4 0,002, бцЯО 0 00025,Мп 804 0,0001, вода 80,0. рМ 6,6.Пендгаситель 0,05. Процесс Ферментации вецут при 34 С с аэрацией втечение 60 ч. Культуральную жидкость, 30имеющую амилолитическув активность301 ед/мл, высушивают на распылительнбй сушилке, Выход сухого продукта 71.Преимущество способа состоит в том, что значительно сокращается время приготовления Ферментационной питательной среды (2-3 ч вместо 8-10). За счет этого увеличивается оборачиваемость оборудования, что позволит получить дополнительный экономический эффект.Температуру ферментации поддерживают в пределах 34-37 С, рН 6-8, Для получения высокого выхода Ф -амилазы рЧ поддерживается в кислой зоне.После завершения Ферментации культуральную жидкость, высушивают, стандартизуют солями и используют в качестве неочищенного ферментного препарата. Для получения очищенного препарата К "амилазы клетки после заверения ферментайии отделяют Фильтрованием или центрифугированием. После отделения клеток очищенный препарат М -амилазы получают из жидкости одним из известных методов, например осаждением с поМощьв растворителя, высаливанием сгущением раствора и тд. ьПо предварительным расчетам экономия от использования способа в промышленности составит 250 тыс.руб./год.