Способ получения изоформ миозина

.ък Е Ир ИДЕТЕЛЬСТВ ОМ АВТ(53) (56) р. 2В 7 9, 1973,975,4,(54) ЗИНА (57) ЗОФОРМ МИО ится к обл ии и биохи Изобретение отно лекулярной биоло ается исследован ти м и ка м структурыличного функГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗО 4103070/31-1325.07.8615.01.88. Бюл. ВЛенинградский госрситет им. А, А,Т. Н, Прияткина,Р. Зарембская663.15(088,8)РеЬз Ьейегз, ч.2-296.осЬешезгу, ч142-747..СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ строения миозинов р 801366) 4 С 01 М 27/26. А 61 К 37/02 ционального назначения, что можетнайти применение в медицинской диагностике, Сущность способа состоит вследующем, Образцы миозина растворяют в 0,1 М трис"глициновом буфере,содержащем пирофосфат натрия (0,080,09 М), этилендиаминтетраацетат(0,001 М) и меркаптоэтанол (1-2 Ж) доконечной концентрации 500-800 мкг/мл.Электрофорез ведут в полиакриламид"ном геле, приготовленном на том жебуфере, что и образец, причем концентрацию акриламида выбирают 4 Е, асоотношение акриламида и бис-акрил"амида 40:1-50:1, и в качестве электродного буфера используют 0,050,07 М трис-глицин, содержащий аденозинтрифосфорную кислоту.Изобретение относится к молекулярной биологии и биохимии, а именно к исследованиям структуры и строения миозинов различного функционального назначения, и может быть использовано в медицинской диагностике.Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса получения изоформ миозина, 10Способ осщуествляют следующим образом.Растворение образца миозина проводят в 0,1 М трис-глициновом буфере, содержащем 0,08-0,09 М пирофосфата 1 натрия, 0,001 М этилендиаминтетраацетата и 1-2% меркаптоэтанола. Электрофорез ведут в полиакриламидном геле, приготовленном на томже буфере, что и образец, причем концентрацию 20 акриламида выбирают 4%, а соотношение акриламида и бис-акриламида 40:1- 50:1. В качестве электродного буфера используют 0,05-0,07 М трис-глицин, содержащий аденозинтрифосфорную кис лоту. Использование данной совокупности признаков позволяет получать 1препаративные количества (1-2 мг в одном цикле электрофореза) изоформ мнозина наиболее дешевым способом с 30 использованием стандартной электроФоретической аппаратуры в трубках или пластинах полиакриламидного геля.П р и м ер 1. Осадок, содержащий 5 мг высокоочищенного миозина из скелетных мышц кролика, экстрагировали 1 ч при 4 С 1 мл 0,1 М трис-глицинового буфера РН 8,9, содержащего 0,09 М пирофосфата натрия, 1-2% меркаптоэтанола и 0,001 М этиленгиамин" 40 тетрацетата. Нерастворимый материал удаляли центрифугированием при 20000 д в течение 30 мин. Концентра" ция миозина в растворе составляла около 800 мкг/мл. К раствору миозина 45 добавляли 10% сахарозы. Готовили полиакриламидный гель (4% акриламида и О, 1% бис"акриламида) на 0,1 М трис" глициновом буфере РН 8,9, содержащем 0,09 М пирофосфата натрия, 0,001 Мэтилендиаминтетраацетата, который полимериэовали в стеклянных трубках (5 мм х 80 мм) с использованием катализаторов ТЕМЕДа (0,4%) и персульфа та аммония (О, 2%) . В каждую тРУбкУ вносили 200 мкл белкового образца (160 мкг миозина), настаивали свер" ху 0,2"0,3 мл 0,1 М трис"глицинового буфера, содержащего 0,09 М пирофосфата натрия и 10% глицерина. В качестве катодного буфера (верхняя камера) использовали 0,07 М трис-глицин РН 8,5, содержащий 0,005 М аденозинтрифосфорной кислоты, в качествеанодного буфера (нижняя камера) использовали 0,05 М трис-глицин РН 8,5,Электрофорез вели в стандартных аппаратах фирмы "Кеапа 1" (Венгрия),включающих 12 трубок, при 4.С, най:пряжении 10 В на см в течение 24 ч.После электрофореза гели окрашивали на белок или АТФазную активностьстандартными методами.П р и м е р 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но растворение миозина проводили в 0,1 М трисглициновом буфере РН 8,3, содержащем0,08 М пирофосфата натрия, 1-2%меркаптоэтанола и 0,001 М этилендиаминтетраацетата. Концентрациямиозина в растворе около 500 мкг/мл.П р и м е р 3. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но готовили полиакриламидный гель, содержапий4% акриламида и 0,08% бис-акриламида.П р и м .е р 4, Способ осуществляли аналогично примеру 1, но в ка"честве электродного буфера использовали 0,05 М трис-глициновый буферРН 8,5, соДержащий 0,005 М аденозинтрифосфорной кислоты,П р и м е р 5. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но полиакриламидный гель полимеризовали встеклянных камерах (1,5 мм х 80 мм хх 140 мм),Формула изобретенияСпособ получения изоформ миозина,предусматривающий приготовление образца миозина, разделение его путемпроведения электрофореза в полиакриламидном геле в электродном трис-глициновом буфере, содержащем аденозинтрифосфорную кислоту, о т л и ч а -ю щ и й с я тем, что, с целью упро"щения и ускорения способа, приготовление образца миозина проводят вО,1 М трис-глициновом буфере, содержащем 0,08"0,09 М пирофосфата натрия,0,001 М этипендиаминтетраацетата,1-2% меркаптоэтанола, при этом электрофореэ проводят в 4%-ном полиакрил"амидном геле, приготовленном на томже буфере, при соотношении акриламида и бис-акриламида 40:1-50:1, а используемый электродный буфер содер"жит 0,05-0,07 М трис-глицина.