Способ выделения раковоэмбрионального антигена

СООЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН А 1(51) 5 А 61 К 39 00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(71) Институт бйоорганической химии АН БССР(56) Свгг 1 со й.,)., га 1 ари - ботег М, - Сапсег Вез.,975, ч. 35,11, р. 2928 - 2934. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РАКОВОЭМБРИОНАЛЬНОГО АНТИГЕНА(57) Изобретение относится к медицине и предназначено для выделения раковоэмбрионального антигена (РЭА). Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта путем- уменьшения этапов выделения до2 х хроматографий и применения нового анионообменника. Проводят экстрацию РЭА из опухслевой ткани. Ткань метастазов рака прямой кишки в печень гомогенизируют, гомогеиат центрифугируют при 9000 д 801363562 30 мин. К супернатанту добавляют равный объем 2 М НС 104, перемешивают 30 мин при 4 С. Осадок отделяют центрифугированием при 9000 д. Супернатант нейтрализу ют до рН 6, 1 М 1 ЧаОН, концентрируют и диализуют. После диализа экстракт центрифугируют при 35000 д 30 мин. Г 1 роводят ионообменную хроматографию на ДЕАЕцеллюлозе, Затем проводят ионообменную хроматографию на АНР-сефарозе, затем гель - хроматографию на сефадексе Сз - 200, Полученный препарат РЭА содержит одну белковую полосу при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, Иммуноэлектрофорез также дает одну полосу преципитации с полиспецифической антисывороткой. Молекулярная масса РЭА, определенная с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. составляет -180000 Д,1363562 формула изобретения 35 40 45 Составитель М. Васильев 1 ф , ,,1 (15 Гяа Техред И, Верес Корректор А. Зимокосов Заказ 1316 Тираж 489 Подписное 111:11 11;рс венного.комитета СССР по делам изобретений и открытий 1111).18, Москва, ЖЗ 5, Раушская наб., д. 415 1 .,по по.и рафиче кое предприятие, г, Ужгород, ул. Ирогктная, 4Изобретение отиос 11 тгя к медицине.1 Рль 1 о изобретения явллот 1 я повышение выхода целевого продукта за счет уменьшеция этапоц выделения ло 2-х хромато. графий и применения нового, аниоцообмен. ника.ПримерЭкстракцин раковоэмбрионального антигена (РЭА) из опухолевой ткани.1 кг ткани метастазов рака примой киш. ки в печень измельчают и гомсгецизируют в 2 л 001 М натрийросфатцого буфера (рН 7,4), солержащего 0,15 м ХаС 1, при 8000 об/мин в течение 5 мин. Гомогенат пентрифугируют при 9000 д в течение 30 мин. К суперцатанту лобавля 1 от равный объем 2 М НС 104, переме 1 цивают в течение 30 миц при 4 С. Осадок отлел 1 ктг центрифугированием при 9000 р ц течение 30 мин. Супернатацт нейтралцзую 1 до рН 6,0М МаОН концентрируют ультрафильтрацией на мембранном фильтре Рипор-120 до объема 240 мл и диализиру 1 от против дистиллированной воды (2 смены по 4 л) в течение 12 ч при 4 С, затем против 0,01 М натрий-фосфатцого буфера (рН 7,4) (2 смены по 4 л) в течение 12 ч 11 ри 4 С, После диализа экстракт цецтрифугцруют при 35000 р в течение 30 мин.Иоообмениая хроматография на ДЕАЕ 32.целлюлозе: Полученный экстракт наносят на колонку 3,5)(23 см с ДЕАЕцеллюлозой, уравновешенну 1 о 0,01 Ю натрий-фосфатным буфером (рН 7,4), солержащим 0,02 о/ Майлз. Элюирование осуцеств,1 як 1 т линейным градиентом О - 0,2 М МаС ц этом же буфере. Скорость элюирования 10 мл/ч, объем элюирующего буфера 900 мл, Фракции (общий объем 220 мл), содержащие РЭА, после концентрирования ультрафильтрацией до 60 мл диализируют против 0,0 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,4) в течение 2 ч при 4 С.Ионообменная хроматография 4 а АНР-сефарозе.Объединенную фракцию после хроматографии на ДЕЛЕ-целлюлозе наносят ца колонку 2,2 К 3 см с АНР-сефарозой, уравновешенную 0,01 М цатрий-фосфатным буфером (р Н 7,4), содержа щим 0,02 Я Ма Мз. Промывают колонкуОО мл стартового буфера со скоростью 10 мл/ч. Элюирование ОСупцЕСтВЛяЮт ЛццЕйц 1 иМ ГрадИЕНтОМ 0 -0,1 М ХаС в 0,0 М натрий-фосфатцом буфере (рН 7,4), солержащим 0,02 Я ЯаМз. Скорость элюирования 1 О мл/ч, объем элюирующего буфера 560 мл, Фракции (общий объем 270 мл), содержащие РЭА, концентрируют ультрафильтрацией до 6 мл.Гель-хроматография на сефалексе 6-.200.Объединенную фракцию после хромато.графин ца АНР-сефярозе наносят на колонку 2,5 Х 78 см с сефалексом 6-200, уравновец 1 енную О,О М натрий-фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,5 М ЬаС 1 и 0,020 Ха 1 Чз, Элюирование проволят со ско.ростыо 1 О мл/ч. Фракции, солержа щие РЭА, объединяют, диализируют против лис. 5 тиллированной воды и лиофилизируют.Количество выделенного РЭА (концентрацию РЭА определяли с помощь о коммерческого набора СЕАК-Р Я фирмы 1 п 1 егпа 11 опа С 1) составляет 120 мг или 12 ф от содержания его в экстракте.20 Полученный данным способом препаратРЭА содержит одну белковую полосу при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецил сульфата катр ия. Им муноэлектрофорез также дает одну полосу преципитации с полисперифической антисывороткой (кроличья антисыворотка к экстракту из опухолевой ткани). При повторной гель.хроматографии препарата РЭА ца сефадексе 6.200 получен один симметричный пик.Молекулярная масса РЭА, опрелеленная о с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии лодецилсульфата натрия, составляет 180000 Д: Способ выделения раковоэмбрионального антигена путем экстракции опухолевой ткани хлорной кислотой с последуо щей ионообменной хроматографией экстракта на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-хроматографией на сефадексе б, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, после хроматографии на ДЭАЭ- целлюлозе дополнительно провОдят хроматографию на аминогидроксипропил-сефарозе с элюцией целевого продукта линейным градиентс)м концентрации хлористого натрия 0 - О, М в 0,01 М натрий-фосфатном буфере рН 7,4.