Способ иммуноферментного определения антигенов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК б 1)4 601 й 33 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ(57) Изобретение относится к биохимиии иммунологии. Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности способа. Фрагменты чистых противодифтерийных антител смешивают сфосфатно-буферным раствором, вносятв лунки планшета и инкубируют. Планшеты промывают, в лунки вносят дифтерийный анатоксин и инкубируют. Послеудаления несвязавшегося антигена ипромывания планшета в лунки вносятконъюгат и инкубируютНесвязавшийсяконъюгат удаляют, планшеты промываюти в лунки добавляют индикаторныйраствор, Результаты реакции оцениваютпо наличию коричневой окраски в рабочем ряду.775 50 ,55 1 1 ЗЗ 7Изобретение относится к биохимии и иммунологии и может быть использовано для количественного иммуноферментного определения антигенов,Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности метода за счет применения в качестве специфических антител Г(аЬ), -Фрагментов иммуноглобулинов, 10Способ осуществляют следующим образом.Иммуноферментное определение дифтерийного анатоксина и токсина: в качестве специфических антител для фик сации на твердой Фазе ("подложка") и для конъюгации с Ферментом испольэовали Г(аЬ) -Фрагменты чистых противодифтерийных антител.Источником антител служила гипериммунная противодифтерийная антитоксическая сыворотка лошадиная (титр антитоксина 400 МЕ/мл),. 1 аЬ) -фрагмен 2 ты чистых противодифтерийных антител выделяли с помощью щадящего гидролиэа 25 иммунной сыворотки пепсином и последующей сорбцией - элюцией на специфическом иммуносорбенте, Специфическим иммуносорбентом служил дифтерийный анатоксин, сорбированный на геле гид рата окиси алюминия. Г(аЬ) -фрагментыг чистых противодифтерийных антител подвергали дополнительной очистке на сефадексе Сдля удаления следов растворимого комплекса дифтерийного 35 анатоксина с Г(аЬ) -фрагментами чистых противодифтерийных антител, Удельная активность Г(аЬ) -фрагментов чис 2тых противодифтерийных антител равнялась 400 МЕ/мг азота. Полученный 40 препарат использовали для фиксации на планшете, а также для приготовления на его основе конъюгата с передоксидаэой хрена (производства объединения Биохимреактив ). Конъюгацию 45 проводили перйодатным методом, Конъюгат очищали на сефадексе С"200 и подвергали лнофильному высушиванию. Для постановки реакции использовали планшеты одноразового применения. В качестве первого компонента, фиксируемого на планшете, использовали Г(аЬ)2 -фрагменты чистых противодиф" терийных антител ("подложка"),Модельным компонентом, являющимся антигенным аналогом дифтерийного токсина, служил дифтерийный анатоксин, который в разведениях наносили в лунки планшета, где он реагировал с поди ЛОЖКОЙ еПроявление связавшегося анатоксина проводили с помощью конъюгата тех же Г(аЬ) -фрагментов чистых противодифтерийных антител с пероксидаэой хрена в присутствии субстратно-индикаторной смеси (перекись водорода + 5- аминосалициловая кислота).П р и м е р, Г(аЬ)2 -фрагменты чистых противодифтерийных антител, разведенные в 0,01 М Фосфатно-буферном растворе, рН 7,2-7,4 до концентрации белка 0,01 мг/мл, вносили в лунки планшета. После инкубации в течениео18 ч при 4-6 С планшеты трехкратно промывали 0,01 М Фосфатно-буферным раствором, рН 7,2-7,4, содержащим 0,052,Твина 20 (этот раствор испольэовали на всех последующих этапах постановки реакции). Затем в сенсибилиэированные лунки вносили серийные разведения дифтерийного анатоксина и инкубировали 1,5 ч при 37 С, После удаления несвязавшегося антигена и трехкратного промывания планшета в лунки вносили конъюгат (Г(аЬ) -фраг 2 менты чистых противодифтерийных антител, меченные пероксидазой хрена в рабочем разведении и инкубировалио1,5 ч при 37 С, Несвяэавшийся конъю гат удаляли, планшеты трехкратно промывали буферным раствором и в лунки добавляли субстратно-индикаторный раствор. Результаты реакции оценивали визуально по появлению коричневой окраски в рабочем ряду и при отсутствии окраски в контрольных лунках (Г(аЬ) -Фрагменты чистых противодифтерийных антител + конъюгат; анатоксин + конъюгат),Таким образом удается повысить чувствительность предлагаемого способа в 10-20 раэ. Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я Способ иммуноферментного определения антигенов, включающий адсорбциюспецифических антител на твердой фа"эе и выявление антигена с помощьюконъюгата специфических. антител с ферментом, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения чувствительности и специфичности способа,в качествеспецифических антител для адсорбциина твердой фазе и для конъюгата сферментом используют Г(аЬ) -фрагменты2антител,