Способ получения антигена вируса для диагностики опухолей

союз советснихсоцидлистичеснихРЕСПУБЛИК да 1 ц 61 К 39 С 12 К 1 рЕ 18702 Л 8 1422) 13 05(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА НЕКРЕЯ 81 ИРЬЕХ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕЙ, заключающийся в том, что почки морских свинок обрабатывают трипсином в присутствии лактальбумина и телячьей сыворотки, полученные клетки культивируют в динамическом состоянии в питательной среде, затем заражают вирусом Негрев Змпр 1 ех с добавлением основной среды Игла и культивируют при интенсивном перемешивании со скоростью 50-60 об/мин в течение 3 ч, далее клетки деэинтегрируют последовательным замораживанием и оттаиванием, и ультразвуковой обработкой, отделяют жидкую фаоте ю ственный комитет ссселдм изобретений и открытий эу, добавляют к ней 20 мИ тис -НСУбуферного раствора, рН 7,2 до 403 ного объемного, насыщения, полученнуюсмесь центрифугируют при 50000 об/мисупернатант насыщают до 803 порошкообразным сульфатом аммония, смесьцентрифугируют при 15000 об/мин, кполученному осадку добавляют тот жебуфер, пропускают через колонку,заполненную ДЕАЕ-сефадексом А 50,при комнатной температуре, элюируюттцс -НС 7 буфером, затем пропускаютчерез колонку, заполненную сефадексом С, и элюируют тем же буфером с добавлением ИаС 1, полученныйэлюат диалиэуют, удаляют не гликозированные протеины с помощью афинной хроматографии на колонке, заполненной смолой сефароэы, связаннойс конканавалином А посредством металлопротеина в присутствии 33-ноговодного раствора М -метил"маннозида при последовательном удалениипоследнего и выделяют гликопр инмол, м. 70000 дальтон,.в частности к иммунологии,Целью изобретения является создание промышленного способа полученияантигена вируса простого герпеса, 5используемого для диагностики опухолей,П р и м е р. У морских свинокв возрасте двух недель удаляют почки. Почки освобождают от оболочек 10и рыхлого слоя и растирают, затем1 добавлярт трипсин в количестве приблизительно 200 мл на каждые 10 почек в присутствии лактальбумина ителячьей сыворотки,1Эту суспензию выдерживают 1 ч при37 С в условиях перемешивания, Затемсуспензию центрифугируют в течение10 мин при скорости 1500 об/мин.Жидкость над осадком удаляют, а осев 2 Ошие клетки промывают с добавлениемпитательной среды лактальбумина)в ту же самую пробирку, затем проводят другое центрифугирование, Сноваудаляют жидкость над осадком, аЧклетки суспендируют в 10 мп питательной среды в той же самой пробирке,После этого суспензию помещают вменьшую пробирку для центрифугирования которое проводят со скоростью1, ЗО1000 об/мин,Из осадка клеток готовят разведение в соотношении 1;200 с использованием питательной среды и телячьейсыворотки, взятой в концентрации10%. Затеи суспензию переносят вовращающиеся колбы, которые послеэтого помещаю в термостат с температурой 37 С на 2/3 сут, В течениеэтого периода питательную среду обновляют один раз, Затеи суспензию4 бцентрифугируют со скоростью 2000 об/минв течение 10 мин, пока на дне пробирки не получится осадок, образрсщий клеточную лепешку, Последнююпомещают во вращающуюся колбу затем45добавляют вирус простого герпеса(ВПГ), перемешивая содержимое со скоростью 50-60 об/мнн в течение 3 чпри 37 С, В течение этого периодаообразуется антиген, который далеебудет называться ТИ, в конце этойстадии получают клеточную лепешку,По завершении процесса из 10 морских свинок получают 288 мкг ТАР с мол, м. ОООО дальтон, добавляют дистиллированную воду и полученный раствор диофнлизируют,659 Подписное Филиал ППП "Патент", г.ужгорсд, уд.Проектная, 4 ВНИИПИ Заказ 88/63 Тираж 74 2содержащую ТАК в необработанном виде. Из 10 морских свинок можно подучить 1,5 мл клеток, К этим клеткам добавляют 1,5 мд тис -буфера для получения 50%-ной клеточной лепешки,Клеточную лепешку хранят в морооэильнике при -80 С из которого ее можно достать для того, чтобы начать очистку ТАГ, содержащегося в 3 мл смеси, от примесей, Ддя этого клетки дезинтегрируют путем замораживания - оттаивания, повторяя эти процедуры трижды и обработкой ультразву ком (0,9 общих килоциклов, 3 раза по 3 мин) Центрифугированием при 27000 об/мин отделяют жидкую фазу, добавляют к ней 20 мИ тис -НС 7 буферного раствора, рН 72, до 40%-ного объемного насыщениясмесь вновь центрифугируют при 50000 об/мин, супернатант насыщают до 80% норошкообразным сульфатом аммония, Полученную смесь центрифугируют при 15000 об/мин К образовавшемуся осадку добавляют тотже буфер, суспензию пропускают через колонку, заполненную ДЕЛЕ-сефадексом50, при комнатной температуре, эдюируют тис -НС т, буфером. Затеи пропускают через колонку, заподненчую сефадексом 6-100, я элюируют буферной смесью трис -НСТ 20 ьиодь/л), далее хроматографируют на ДЕАЕ-сефа-дексе А 60, промывают раствором тряс -НС 7 (20 ммоль/д), элюируют раствором ЯаСУ в тис -НС 7 (30 ммоль/л), удаляют ХаС 7 из элюированной жидкости с использованием диализной системы ДС"2, удаляют нв гликозированные протеины с помощью афинной хроматографии на колонке, заполненной смопой сефарозы, связанной с конканавадином А посредством металлопротеина в присутствии 3%-ного водного раствора Ж -метил-маннозидадиализуют для удаления последнего и выделяют целевой продукт.