Способ получения гетерополисахарида

И 1/20/12 К 1:6 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ПИСАНИЕ ИПАТЕНТУ ТЕНИЯ тся к биотех 8-13 соба полученияисахарида, коьзован в качета в пищевых 14исерч Маат т.ц. Цельовышение вы Бюл. рнэшнлимически КВ) заклюштамма 11854, ростью ивность ка 14 г/ ид Даун 8.8)ША 1 Ф 34 69вого ИС 1 В й ск й ак ГЕТЕР 0110 ЛИСАХА 54) СИОСОВ 1 ЮЛУЧЕНИЯИЦА оря(71) Шелл Инте пий В.В. (М) (,72) Джон Дэв (53) 663, 15(0// С 12 И 1/20, 57) Изобретение относ нологии и касается спо ксантанового гетеропол торый может быть испол стве эективного аген продуктах, косметике и изобретения является и хода и улучшение Физик свойств полисахарида. чается в выращивании н ХапЬопюпав сашревСгв который обладает высок роста и биосинтетическ и способен накапливать полисахарида. 6 табл. Всесйр)щдщ 11,389683 18 Та блица 6 Образец Штамм 5 р + ПФ" А. В 12 ИаС 1 + 0,17 СаС 1 при 30 С и избыточном давлении 1 атм ОСХВ Бульон 11,0 63,0 0,71 11854 Обработанный 9,5 29,3ФерментомЯВИ. Бульон 17,5 59,6 0,73 0 74 ВОбработанный ферментом 19,0 188,0 0,74 В. В 17. ЯаС 1 + 0,17 СаС 1 при 70 С и избыточном давлении 1 атм ЯС 1 В Бульон 37,3 7,5 0,71 11954 Обработанный 5 у 5 17,0ферментомВКИ Бульон 35,8 50,7 0,73 0,74 ВОбработанный 8,5 40,9 ферментом 0,77 С. В 157 МаС 1 + 1,5 Х СаС 1 при 30 С и избыточном давлении 1 атм 14,5 0,58 330 Бульон ИС 1 В 0,56 101 11854 22,1 0,61 30,8 81,7 1000 0,63 1000 ВВ 153 МаС 1 + 1,5 Х СаС 1 при 70 С и избыточном давлении 1 атм 0,58 299 17,0 Бульон НС 1 В 1000 0,56 11854 1000 1000 1000 0,61 0,63 1000 В1000 5,8,6 17 ф 5 188,0 19,0 ВВ. В 37,3 7,5 Бульон ИС 1 В ОбработанныйферментомБульон Обработанныйферментом ОбработанныйФерментомБульон ОбработанныйферментомБульон Обработанный энзимом1 Е ИаС 1 + 0,1 Х Время фильтрования для 200 мл, с Сухой вес полим./л1,2 р СаС 1 при 70 С под давлением 1 атм)10 т 100 145 Х СаС 1 при 70 С и давлении 1 ат 17,0 ул 00 00 854 000 Бульон 1000 1 О Пф - префильтр дляБез предварительно 5 + префильтр.опускали чер ОбработанньэнзимомБульон энзимо С, В 157. ЫаС 1-1459 Обработанныйэнзимом арации грубофильтра, но териал ор ран Продолжение табл.6 Сухой весполим./л138 9683 Ярема ф) Фиг 3 Составитель 3:фалунинедолуженко Техред М.Коданич едактор М орректор А,Обручар каз 158 венно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород,оиз роектна Тираж 520 ИИЛИ Государственного но делам изобретенийи .", Москва, Ж, Раушс Подпис ноеомитета СССРоткрытийая наб., д. 4/5Изобр.тение относится к биотехнологии и касается способа полученияксантанового гетерополисахарида, который может быть использован в качестве эффективного агента в операцияхпо вторичной регенерации масел, за"густителей в пищевых продуктах, косметике и т.д. и также в качествеагентов, способных образовывать съедобную пленку, и в качестве эмульгирующего агента, например, в чернилах для печатания, а также в качестве загустителя в пастах для печатанияв текстильной промышленности, 15Целью изобретения является увеличение выхода и улучшение физико-химических свойств полисахарида.Новый штамм; Хап 111 ошопая сашреяг 1 ядепонирован в Национальной Коллекции 20Промьлпленных Бактерий, Торри РисечСтейшн, Абердин под номером 11854,Ытамм КСХВ 11854 демонстрирует болеевысокую скорость роста в синтетической солевой среде, значительно более 25высокую специфическую скорость производства полимера и его можно выращивать как в непрерывных условиях,так и периодических,Национальная Коллекция Промышлен-. 30ных. бактерий располагает также штаммом ИСХВ 11803, который обладает,сходными признаками со штаммом МСХВ11854Морфолого-культуральные и фиэио 35лого-биохимические признаки штамма.Морфолого-культуральные признаки,А. Окислительный питательный бульонСМ 1 + 0,751 агара Дифко инокулировалимолодыми выросшими микроорганизмамии ипкубировали в течение 7,5 ч при25 С. Клетки с пятен размером выросшей культуры 0,2 мм исследовали и фо.тографировали на месте (п я 1 Си) прифазовом контрасте со скользящей диаф 45рагмой. Подвижность и другие характеристики определили в пулах, окружающих О, 1 р м стеклянные шарики, расположенные на других пятнах. Клетки накраях выросшей культуры встречалисьпо одной и парами, при этом размер50клеток составляет: ширина 0,4-0,5 р ии длина 1,2-2,5 р м для ЫСХВ 11803ширина 0,5-0,6 Нм и длина 12-2,5 рмдля КСХВ 11854, На полях выросшихкультур в пулах видны агрегаты, сос 55тоящие по количеству от сотен до нескольких тысяч клеток с НСХВ 11803,но намного реже с ИСХВ 11854. Мобиль Питательный бульонР 2 (Оксоид)Желатина (Дифко)Желатиновые чашки.У.:Питательный агаровыйоксоид СМЗЖелатинаМолочные чашки, /:Снятое молоко(Дифко), отдельностерилизованноеПептон (Лифко)Экстракт ветчины1.аЪХ,ешсо О,1ИаСХ 0,5Агар 1,5рН 7,4 до автоклавирования 2,512,0 2,81,0 3,0 0,1 ность положительная. При использовании условий, как в А, но с добавлением 0,5 Е глюкозы в среду и инкубированием в течение 7 ч, получили аналогичные результаты, за исключением того, что клетки были на О, 1 р м шире и не были видны агрегаты с ИСХВ 11854.Б. После выращивания в течение 48 ч при 30 С в чашках с окислительным питательным агаром СМЗ наблюдали хороший рост, выделенные колонии желтого цвета, круглые, целые, слизистые, гладкие, волокнистые и выпуклые. Диаметр колоний для 11803 1-1,5 мм для МСХВ 11854 1,5 мм.В. Спустя 72 ч после начала выращивания при 30 С на среде, аналогичной в А, но с добавлением 1 У глюкозы, рост был хорошим, выделенные колонии бледно-кремового цвета, круглые, целые, очень слизистые, гладкие и выпуклые, в то время как выросшие слившиеся колонии желто-кремового цвета. Диаметр колоний для ЫСХВ 11803 2 мм и для 11854 2,2,5 мм.Селективная морфология. Минеральное основание Паллерони 6 Доудорофф 1972 модифицированное (РР), г:ИаНРО 12 Н)О 6,0 КНРО 2,4 1)Н,СХ 1,0 М 8804 7 Н,О 0,5РеСХз 6 НО 0,01 СаС 1 6 Н О 0,01 Деионизированнаявода До 1 лрН 6,8РР минеральное основание + 0,17.фильтро-стерилизованная глюкоза20 Биохимические характеристики: при30 С за исключением особо оговоренных случаев, рост при 0 С на СМЗчашках:Температура, С 5 3 37Рост (не количественный) + +Интервал ростарН на СМ 1 буль 10оне (выверенныйрН)рН 35 728 9 10Рост 3+ 3+ 3+ 3+ 3+Рост в присутствии соли, Основнаясреда, содержащая МаС 1 в концентрации2,3,4 и 5%, приготовлена в соответствии со способом по Хейварду и Ходжкису. Культуры инкубировали в течение3 дней.МС 1 В 11854 менее терпим к соли,чем МС 1 В 11803.МаС 1, 7 2 3 4 5МС 1 В 11803 рост 3+ 3+ 3+МС 1 В 11854 рост 3+ 3+ +Гидролиз желатины и казеина,Культуры инкубировали в течение7 дней. Желатиновые столбики содержались при 20 С. МС 1 В 11854 показалменьшую степень протеолитической активности, чем МС 1 В 11803 (см. табл.1),Тесты на требования факторов роста,Субкультуры подготовили в виде прямой проволоки трижды в среде РВС сдистиллированной водой на стекле.Получили удовлетворительный рост че"рез 4 дня, при этом особых требований к факторам роста не было.Тест на стимулирование метионимом.Одну каплю слегка мутной молодой выросшей культуры в среде РВС с дистиллированной водой на стекле инокулировали в РВС с и без 10 / г/мл 1.-метионином в 1 мл в 16 мм трубках. Фактастимуляции скорости роста Е-метиони 45ном не наблюдали.Использование источника углерода.Среду РВ с одними источниками углерода (О, 17), стерилизованными сфильтром (табл. 2), инокулировали иинкубировали в течение 14 дней, Обнаружили слабые расхождения в скоростях роста между штаммами,Получение кислоты из углеводов,К окислительно-ферментационнойсреде Хейварда и Ходжкиса добавили 12 55стерилизованных с .фильтром источни-ков углерода, приведенных в табл. 2(знак + - вместо ВЕ). Трубки инокулировали и инкубировали в течение14 дней. Кислоту получали из галакто,зы и мелибиозы с помощью МС 1 В 11854,но не МС 1 В 11803.Грамотрицательные неферментативныевещества даны в табл. 3,Приведенные данные свидетельствуют о том, что штамм 11854 демонстрирует лучшую кинетику производстваполимера в определенной среде, лучший:рост с неорганическим азотом (в особенности МН +) и стабильность в непрерывной культуре в синтетическойсолевой среде.Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р. ХапгЬошопая сашревггдяМС 1 В 11854 выращивают.на трех различных химических синтетических солевыхсредах (табл. 4) в сосуде емкостью 7 л,в циклических условиях.В первом эксперименте единственным источником азота для роста микроорганизмов служит ион аммония (24 мМ),позволяющий достичь экспонентного роста клеток до максимальной концентрации 3 г/л.Во втором и третьем экспериментахаммоний заменяют нитратом (24 мМ) иглютаматом (24 мМ) соответственно.Результаты приведены на фиг, 1-3.Как видно из сравнения схем пофиг. 1-3, глютамат как источник азота является наиболее предпочтительным, поскольку он дает р макс, т.е.максимальную скорость роста клетокО, 12 ч ", пп величину, т.е. специфическую скорость производства полимера в 0,36 г (г ") ч и конечный выходполимера В0,59 гл . Эта комбинация высокоймакс и высокой цп даетпродуктивность полимера в .итоге 0,49 г(1 ) ч , что вдвое больше обычнойпродуктивности гетерополисахариднойферментации с использованием ХапгЬошопав сашреяггдя МКК 1,В.На табл. 5 (А) приводится р макс,1 п, гг , т.е. специфическая скоростьрасхода глюкозы, В и - выход полимерана глюкозе и П - полимерный продуктдля ХапгЬошопав сашреяггдя МС 1 В11854, в определенной выше ростовойсреде с солями и (В) - соответствующие величины для Хапгпошопая сашреягггв МИ 0, В.Условия роста для культуры ХапГЬошопав сашревггя МС 1 В 11854 следующие:5Температура,СрНИмпеллер 1389683 286,8Турбина Раштона с лопастями 3 4 1,0 20,0 х 10 з 10, Ох 1010 х 101 Ох 10Дол Таблица Штамм ЮС 1 В 11803 +ХС 1 В 11854 слабый Скорость импеллера, об/мин 1000Объем культуры, л 4,5-5,0рН контроль 1 В ИаОН+щ КОНДавление растворенного О 80 мм НяСкорость потокавоздуха, л/мин 1,0Как видно из табл. 5, улучшилосьдействие Хапййошопав сашрезггхз МС 1 В11854 в сравнении с ХапйЬопюпазсашрезгв ЯВИ. В.В табл. 6 даны сравнительные данные фильтрационной способности ХапгЬо.20пюпаз сашревг 1 з 11854 бульона сфильтрационной способностью ХапгЬошопав сашрезггз ЯВИ Вбульонапри раэбавлении до постоянной вязкости в растворах различной солевой 25концентрации. Фильтруемость растворов .с вязкостью 20 с 11 э (вязкость измеренапри коэффициенте сдвига 7,5 с " ).Для фильтрации используют фильтры"Миллипор" (торговая марка), имеющиедиаметр 47 мм 5 ри 1,2 р - размерыпор. Как видно из табл. 6, фильтруемость бульона с ХапйЬршопаз сашрезг.гдз ИСХВ 11854 до и после знзимати"ческой обработки значительно лучше,35чем у известного,Формула изобретения Способ получения гетерополисахари1да, предусматривающий выращивание микроорганизма-продуцента вида ХапЬопюпаз сашрезггз на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, источники азота, фосфо ра, минеральные соли и воду, в условиях аэрации и перемешивания до максимального накопления целевого продукта и последующее его выделение, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода и улучшения физико-химических свойств гетерополисахарида, в качестве микроорганизма-продуцента используют штамм ХапТЬошопаз сашревг 1 в ИС 1 В 11854, при этом в питательную среду в качестве источника азота вводят глютамат натрия, минеральных солей - хлористый кальций двуводный, серно-кислые магний, железо (11), марганец, цинк семиводные, серно-кислую медь пятиводную, хлористый кобальт шестиводный, молибденовокислый натрий двуводный, йодистый калий и борную кислоту при следующем соотношении входящих в нее ингредиентов, г/л воды:Глюкоза 23,4Глютамат натрия 24,0Фосфорно-кислыйкалий однозамещенный 25,0Фосфорно-кислыйнатрий двузамещенный 25,0Хлористый кальцийдвуводныйСерно-кислый магнийсемиводный 2,0Серно-кислое железо (11) семиводное 0,2Серно-кислый марганецсемиводный 20,0 х 10-3шестиводный О,Ох 10Молибденовокислыйнатрий двуводныйЙодистый калийБорная кислотаВода Желати- Желати- Молочнаяновый новая чашкастолбик чашка1389683 Т а б л и ц а 2 Рост на одном источнике углерода МС 1 В МС 1 В11803 11854 МС 10 ИС 1 В11803 11854 Рибоза Ксилоэа Следы Слабый Слабый Арабиноза Слабое Слабое Рамноза Глюкоза Фруктоза Сахароза Трегалоэа Целлобиоза Слабое + 2-КетоглюконатСахаратЖирные кислотыАцетат Слабый Слабый Пропионат Бутират ДикарбоновыекислотыМалонат Слабый + Оксикислоты Р(-)-тартрат Мезо - тартрат ЭЕ-гидроксибутират РЕ-лактат Глюколлат Другие органические кислотыЛевупинат Цитраконат Углерод и произ- Производство кисловодные сахара ты иэ О- Р среды1389683 ис- ода 188 Мезаконатахарные спи гликоли рбит Мезо-инозиАдонит опиленгликоль2,3-БутилгликольВ-Маннит нСпабое Слабый+ лаб Эта Геран эазот к Мета ксиб идрозаат Пара-гидроксибензоат Тестостерон Алифатические аминокислотыЬ-Валин Ь-Аргинин + инокислоты, имеюе кольцевую рукту Гист-Триптоф АнтранилатАмины Бензиламин Углерод и и водные саха ГлицеринСпирты Метанол ароматические и другинения Продолжение табл. 2 ские .соедиУглерод и пр водные сахар Триптаминамиламин зличные сое инения Бетаи+ Манноза Добавочное соединение Табли Показате 803 11854 11803 11854 118031854 3 3 т при, С ый д ичне гмен в куль м булв туральнонеАрг. М 1 о- 3 г Ъетаин СБ- 37 С Лиз. М 11 Глюкоза СБП н, М 11 ег Рост пр рН 3- 5 3+ 3 д тат СБ Пантотенат Углеводы и про изводные сахар (продолжение)Галактоза актоза МальтозаМелибиоэа Температура инкубации, С 30 Пи о циа ни нФлуоресценция Ко Е-Арг С БП Пи 1389683 12 Продолжение табл. 2 Вьщеленньп БС 1 В+ трацикл Лецити овобио Полимиксин В О/1 Леван В трипроновобульоне идол Н,(ТЫ) -Пепто- Пенто Рнизи низиМолок рова- ровано ноВыделе- Выделе- Аргно но Торил Требования к факторам роста Остат. ИОДНК-аза Глюко- (Глйко за СЯП) за" СЯБ ЯичныйЛипазаЯйца 7,2 3+ -8 3+ +9 3+ 2% 3+ 3+ 37. 3+ 3+ б, 47. 3+ 3+ оричневыииффундируюий пигмент