Способ определения нуклеотидной последовательности днк и устройство для его осуществления

Есть еще 3 страницы.

Смотреть все страницы или скачать ZIP архив

Текст

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННО ВЕДОМСТВО ССС (ГОСПАТЕНТ ССС ПАТЕНТНО ТЕНИ ТЕНТУ еотидов длиа стеклянной ие гибридизаесцентно меопределение исследуемой эу радиограивности флуах.б не обладает ительностью, лучае анализа ДНК проведебридизаций и ьного досинатрицы олигоОПИСАНИЕ ИЗО(71) Институт молекулярной биологии им.В,А.Энгельгардта(73) Институт молекулярной биологии АНСССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК ИУСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к определению последовательности нуклеотидов в ДНК методом гибридизации,Известен ряд методов анализа нуклеотидной последовательности и распознавания одиночных замен оснований при помощи гибридизации.Распространенными являются методики, которые заключаются в том, что тестируемый фрагмент ДНК закрепляют на мембране и гибридиэуют с меченными олигонуклеотидами.Наиболее близким к заявляемому является способ и устройство для определения нуклеотидной последовательности ДНКЯ 21794088 АЗ(57) Использование: молекулярная биология, в частности определение последовательности нуклеотидов в ДНК методом гибридизации. Сущность изобретения; на стеклянной подложке формируют матрицу из геля-носителя, наносят набор нуклеотидов, проводят гибридизацию с меченной тестируемой ДН К, гибридизацию и отмывку проводят при одинаковой температуре и определяют одиночные замены оснований в тестируемой ДНК по анализу распределения метки. Устройство для осуществления способа представляет собой стеклянную подложку и матрицу, представляющую собой одинаковые участки геля толщиной 10-30 мкм с наибольшей длиной 25 - 100 мкм с расстоянием между участками, равным удвоенной наибольшей длине, 2 с.п, ф-лы, 7 лл, 1 табл. включающий синтез олигонук ной от 8 до 20 нуклеотидов н подложке-носителе, проведен ции с радиактивно или флуор ченной тестируемой ДНК, наличия одиночных замен в последовательности по анал фического рисунка или интенс оресценции в отдельных точкОднако известный спасо достаточно высокой чувств громоздок, так как требует в с даже фрагмента тестируемой ния ряда последовательных ги соответственно последовател тезирования используемой м1794088 ор А, Савина Корректор М Ткач акаэ 524 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 1 СоставитТехред Мнуклеотидов с ша ом в одну букву во всех точках, где гибридизация не дает однозначной информации о последовательности, при этом каждый раз выбор новых оптимальных условий гибридизации (температуры, концентраций реагентов и т.д,) требует дополнительных значительных затрат при том, что упомянутые операции плохо или вообще не поддаются автоматизации,Целью изобретения является повышение чувствительности, точности и воспроизводимости способа и устройства, упрощение определения известных точечных мутаций в нуклеотидной последовательности, снижение затрат и возможность автоматизации процессов,Поставленная цель в способе доститается тем, что меченную тестируемую ДНК гибридизуют со всем набором олигонуклеотидных проб, иммобилизованных в ячейки геля-носителя, нанесенного на подложку, гибридизацию и отмывку проводят при одинаковой температуре,Поставленная цель в устройстве достигается тем, что матрица представляет собой одинаковые участки геля толщиной 10-30 мкм, наибольшей длиной 25 - 100 мкм и с . расстоянием мекду участками, равным удвоенной наибольшей длине.Способ осуществляют следующим образом,Два предметных стекла, одно из которых предварительно обрабатывают Впб ЯИапе, а другое- Вере ЯИапе и покрывают тонким слоем Тг 1 опХ, устанавливают дистанционно с помощью прокладок толщиной 10-30 мкм, образованный зазор в "сэндвиче" заполняют гелеобразующим раствором и оставляют до полного гелеобразования, После этого верхнее стекло снимают. Стекло со слоем геля обрабатывают 50 -ым раствором гидразина, подсушивают, часть геля удаляют так, что на поверхности стекла остаются одинаковые участки-ячейки геля с наибольшей длиной 25-100 мкм и промежутками между ними, равными удвоенной наибольшей длине. .Полученную поверхность обрабатывают в течение 2-5 мин Вере ЯИапе, промывают спиртом, затем бидистиллятом и высушивают, Олигодезоксинуклеотиды, содержащие на 3 -конце З-митилуридин, окисляют 1 мМ периодатом натрия в течение 10 мин - 1 ч и ри комнатной температуре, осаждают 10-ю объемами 2 -гоС 04 в ацетоне и растворяют в воде. Из необходимого набора в ячейки воздушно сухой матрицы наносят одинаковые по объему микродозы окисленных олигонуклеотидов, причем в каждую ячейку строго одного типа. При этом их концентрации в микродозах различны и подобраны так, что соответствуют одинаковой оптимальной температуре гибридизации и плавления совершенных дуплексов, образо ванных иммобилизованными олигонуклеотидами с фрагментами ДНК. Гибридизацию флуоресцентно или радиоактивно меченных фрагментов тестируемой ДНК проводят при оптимальной температуре и влажности, на нося ее на поверхность матрицы. Определяют наличие одиночных замен в исследуемой последовательности по анализу радиографического рисунка или интенсивности флуоресценции в отдельных ячейках.15 На фиг.1 представлено устройство вразрезе (позиция а) и вид сверху (позиция б); стеклянная подложка 1, ячейки 2 геля,Способ поясняется следующим:На фиг,2 - схема химических реакций 20 при иммобилизации олигонуклеотида в полиакриламидный гель-ПААГ; на фиг,З - кривые отмывки АТ-богатых (позиция а) и 6 С-богатых (позиция б) дуплексов (мисматчи выделены жирным шрифтом; М - матри ца); на фиг.4 - зависимость отмывкидуплекса (показан вверху рисунка, М - матрица) от концентрации иммобилизованного олигонуклеотида. В пятне объемом 0,03 мм иммобилизовано 5 (1), 1,5(2), 0,5 (3) и 0,15 (4) 30 пмоль олигонуклеотида; на фиг.5 - уравнивание температур отмывки АТ-богатых и ОС- богатых дуплексов путем подбора концентраций олигонуклеотидов, иммобилизованных в геле. (Структура дуплексов и 35 концентрации иммобилизованных олигонуклеотидов приведены на фиг,5 справа; М - матрица); на фиг.6 - обнаружение мисматчей в дуплексах разного ОС-состава на матрице с "приведенными" концентрациями 40 иммобилизованных олигонуклеотидов. Гибридизацию и отмывку проводили при 35 С.Остаточная радиоактивность приведена в процентах к уровню радиоактивности фрагмента ДНК, взятого для гибридизации; на 45 фиг.7 - гибридизация (позиция а) и отмывка(позиция б, в) флуоресцентно меченных фрагментов ДНК на "гибридизационном чипе" (1,4 - те же дуплексы, что и на фиг,З, позиция б). Размер квадратика 0,1 х 0,1 мм,50 г - . демонстрация чувствительности метода:ячейки 1, 2,и 3 содержат соответственно 1 фмоль, 100 амоль и 10 амоль тетраметилродаминоцого производного дезоксиуридина.П р и м е р 1. Возможность испольэова ния геля в качестве носителя в предлагае,мом способе и устройстве подтверкдается следующим примером.Олигонуклеотиды были синтеэированытвердофазным фосфорамидитным методом (снятие защит проводили в насыщенномводном растворе аммиака при 55 С в течение 12 ч) и очищены электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях.Олигануклеотиды метили Р(у Р)АТР и полинуклеотидкинэзой Т 4) по 5 -концу до специфической активности 3 мкКи/пмоль.Из двух предметных с 1 екол, одно из которых обработано Впб ЗИапе, а другое - Вере ЯИапе ( КВ) и покрыто тойким слоем ТгтопХ, собирали "сэндвич" как для заливки плоских полиакриламидных гелей с прокладкой толщиной 30 мкм, Сэндвич заполняли раствором 8 -го акриламида, 30:1 К,К -метиленбисакриламида, персульфатэ аммония и ТЕМЕО (как для заливки ПААГ) и оставляли для полимеризации на 1 ч, После полимеризэции верхнее стекло снимали, Стекло со слоем полиакриламида обрабатывали в течение часа при комнатной температуре 50%-ным гидразином, Для формирования матрицы часть геля удаляли, Олигодезоксинуклеотиды, содержащие на З -конце З-метилилуридин, окисляли 1 мМ периодатом натрия в течение 1 ч при комнатной температуре, осаждали 10%-ю объемами 2%-го ООО 4 в ацетоне и растворяли в воде. На воздушно сухую матрицу для иммобилизации с помощью микроманипулятора, снабженного дозатором с капиллярной насадкой, наносили капли по 0,5 мкл окисленного олигонуклеотида (в концентрации 10 пмоль/мкл, если не оговорено особо), Пластинки помещали на 4 ч во влажную камеру, сушили 0,5 ч на открытом воздухе, промывали гибридизационным буфером (см, ниже), ополаскивали водой и хранили воздушно сухими при - 20 С. Тонкие гели достаточно прочны и удобны в работе, позволяют благодаря прозрачности определять интенсивность флуоресценции при помощи микроскопа. Судя по изображениям то,ек иммобилизованных олигонуклео-.тидов, гибридизованных с флуоресцентно мечеными фрагментами ДНК, олигонуклеотиды иммобилизуются в вие компактного пятна площадью около 1 мм, Как правило, олигонуклеотиды иммобилизовали в ячейках квадратной матрицы, которая в дальнейшем называется "олигонуклеотидной матрицей".В качестве линкера выбран 3-метилуридин, присоединенный 5 -3 -меж нуклеотидной фосфодиэфирной связью к иммобилизуемому олигонуклеотиду. Выбор 3-метилуридина определялся тем, что он не образует прочных водородных связей ни с одним из природных оснований,Окисление 3 -концевого рибонуклео зида олигонуклеотида 1 МаЮ 4 приводит к производному 2 несущему на 3-конце диэльдегидную группировку. С другой стороны, при обработке полиакриламидэ 3 гидразином часть эмидных.групп замещается нэгидразидные 4, которые легко реагируют с5 3 -диальдегидом. При этом образуется относительно стабильное морфолиновое производное 5 (фиг.2),Ход иммобилизации контролировали по(5 - Р) метке, введенной с помощью кина-.3210 зы в иммобилиэуемые олигонуклеотиды,Выход иммобилизации, т,е. доля олигонуклеотида, необратимо связавшегося с гелем,800 . При этом та же величина для неокисленного олигонуклеотида, использованного15 в качестве контроля нэ неспецифическуюсорбцию, составила менее 2%. Таким образом, доля молекул, связанных специфически за 3-конец, превышала 980 ,Связь олигонуклеотида с полиакрила 20 мидом устойчива, и матрица выдерживаетне менее 5-7 циклов гибридизации/отмывки без заметного изменения гибридизационных свойств, Время полураспада связиолигонуклеотид-гель при 60 С составляет 225 ч, а при 25 С - 36 ч.Емкость носителя оценивали путем иммобилизации одного и того же количества32Р-меченого олигонуклеотида, разбавленного немеченым до различной специфиче 30 ской активности, 100 пмоль холодногоолигонуклеотида на точку (т.е. на 1 мм поверхности или 0,03 мм обьема геля) не на 3сыщали связывания. Аналогичныеэксперименты с окисленным периодатом35 а -РОТР показали, что емкость геля составляет около 1 нмоль на 1 мм поверхности геля. Это соответствует концентрации30 мМ активных групп (концентрация амидных групп в 8%-ном полиакриламиде со 40 ставляет 1 М);П р и м е р 2, Гибридизация и дискриминация мисматчей в предлагаемом способеподтверждается следующим примером.. На подготовленной, как в примере 1,45 олигонуклеотидной матрице была проведена гибридизация четырех гептадекануклеотйдов - сиквенсового праймера фага М 13:5-б(ОТААААСАСОССАОТ) и трех его производных, отличающихся одним основанием50 (подчеркнуто):5 -б(ОТААААСОАТООССАОТ)5 -б(СТААААСОААОО ССАОТ)5 -б(ОТААААСОАСО ОО ССАОТ)с иммобилизованными в геле олигонуклео 55 тидами (длиной 7, 8, 9, 12 и 15 мономерныхзвеньев), полностью или частично комплементарными различным участкам гептадекамеров,Меченный фрагмент ДНК (0,1 мкКи, 30фмоль).в 1 мкл буфера гибридизации (1 Мчисло 7-, 8-, 9-, 12- и 15-членников, полностью или частично комплементарных праймеру М 13. а также дуплексов, содержащих другие типы мисматчей. Даннце по отмывкедуплексов гептадекадезоксинуклеотидов с иммобилизовэнными октадезоксинуклеотидами приведены в таблице.Как видно из фиг.З и таблицы, почтивсегда существует такая температура, прикоторой отношение гибридизационных сигналов полностью комплементарного и соответствующего дефектного дуплексадостаточно велико (не зеленее 10 раз), чтобы надежно различить их. Исключение составляют некоторые краевые мисматчи, стабильность которых аномально высока, Однако этот факт ни в коей мере не огрэниМаС 10 мМ фосфат, рН 7,0, 1 мМ ЕОТА) наносили на матрицу с иммобилизованными олигонуклеотидами так, что каждая капля гибридизационной смеси в точности покрывает точку иммобилизованного олигонуклеотида и инкубировали 1 ч при 0 С. Пластинку ополаскивали буфером гибридизации при 0 С, затем отмывали 10 раз по 1 мин 20 мл того же буфера при температуре, повышающейся на 5 С на каждой ступени отмывки, После каждой ступени гибридизационный сигнал регистрировали через свинцовый коллиматор в каждой точке счетчиком радиоактивности (Мпгпопаког 125, Иссогееп, США), снабженным сумматором импульсов.Отношение остаточной радиоактивности к исходной в данной точке откладывали на графике в логарифмическом масштабе в зависимости от температуры, Соответствующую сглаженную кривую мы будем называть в дальнейшем "кривой отмывки" дуплекса (фиг;3),В качестве меры стабильности дуплексов выбрэлй температуру отмывки (Т), которую определили как температуру, при которой гибридизационный сигнал в соответствующей точке уменьшается в 10 раз по отношению к исходному уровню. На фиг,З представлены кривые отмывки дуплексов, образованных праймером М 13 или его аналогами с ОС(фиг,З,а) и АТ-богатыми (фиг.З,б) октэнуклеотидами, иммобилизованными в геле, комплементарными двум различным участкам праймера М 13, но образующими дефектные дуплексы с его производными (все дуплексы представлены на фиг;3). В дальнейшем 17-членные дезоксиолигонуклеотиды в отличие от иммобилизованнь 1 х олигонуклеотидов мы будем называть "фрагментами ДНК".Кроме олигонуклеотидов, показанныхнэ фиг.З, было исследовано значительное 5 10 15 20 25 30 35 40 чивает применимость предлагаемого способа, Действительно, при исследовании известных последовательностей (например, выявление мутаций) всегда можно выбрать такой иммобилизуемый олигонуклеотид, чтобы ожидаемая замена оснований оказалась внутри дуплекса, С другой стороны, при анализе неизвестной нуклеотидной последовательности (сиквенс ДНК) проблема краевых мисматчей относительно легко решается при обработке на ЭВМ результатов гибридизации фрагмента ДНК с "полной" олигонуклеотидной матрицей. Способ обладает большой устойчивостью за счет избытка информации (в случае гибридизации с октануклеотидами мы получаем 7-крэтный избыток информации, причем любой нуклеотид фрагмента ДНК в шести случаях из восьми образует внутреннюю пару с иммобилизованным олигонуклеотидом и лишь в двух случаях - краевую).Таким образом, сравнение кривых отмывки позволяет различать полностью комплементарные и дефектные дуплексы и таким образом обнарукивать одиночные замены оснований в ДНК.Зависимость кривых отмывки дуплекса от обьемной концентрации иммобилизованного олигонуклеотида в геле, Как видно из фиг.4, Т дуплекса сильно зависит от количества олигонуклеотида, иммобилизованного в пятне данного размера. Для исследованного интервала концентраций в пределах экспериментальной ошибки температура отмывки дуплекса повышается на определенное число градусов при увеличении концентрации иммобилизованного олигонуклеотида в определенное число раз. Данное правило выполняется для всех исследованных дуплексов (нэ фиг.4 приведен один из многочисленных примеров).Это позволяет обнаруживать мисматчи в дуплексах разного ОС-состава "на одной пластинке", Кэк видно из фиг.З, показанные там двэ иммобилизованных олигонуклеотида настолько различаются по ОС-составу, что п ол н остью комплемента рн ы й дуплекс АТ-богатого олигонуклеотида (фиг,3,а, кривая 1) менее устойчив, чем дуплексц ОС-богатого, содержащие мислэтчи (фиг,Зб, кривые 2 и 3). Очевидно, что в такой ситуации гибридизация фрагмента ДНК с матрицей, на которой иммобилизованц оба олигон,.;леотида, при любой фиксированной тем - ,ературе не позволяет узнать с точностьюо одного основания, иивются ли в данном фрагменте комплемент;1 нпе им последовательности или нет.Сбнаруженнэя намизависимость Т от концентрации имлобилизолэноо олиго5 10 15 20 25 30 35 45 50 55 нуклеотида позволяет решить проблему уравнивания температур диссоциации дуплексов различного ОС-состава наиболее простым и изящным способом. Как показано на фиг.5, кривые отмывки АТ- и ОС-богатого дуплексов (Л Т = 30 С при равных концентрациях) могут быль полностью совмещены путем подбора концентраций иммобилизованных олигонуклеотидов в соответствующих точках.Можно совместить кривые отмывки для любого набора олигонуклеотидов и таким образом получить "приведенную" матрицу олигонуклеотидов. Температуры отмывки полностью комплементарных (совершенных) дуплексов для всех точек такой матрицы близки между собой, что позволяет с помощью всего одной отмывки при оптимальной температуре однозначно определить те точки матрицы, с которыми анализируемый фрагмент ДНК образовал совершенные дуплексы.Дополнительное достоинство "приведенной" матрицы заключается в том, что все ее точки можно не только отмывать, но и гибридизовать при той же оптимальной температуре, что существенно упрощает процедуру анализа. Гибридизация и отмывка при одной и той ке оптимальной температуре увеличивает разрешение метода.Указанный принцип проиллюстрирован в модельном эксперименте (фиг.б). "Приведенную" матрицу олигонуклеотидов (по три точки какдого из двух) гибридизовали и отмывали при 35 С, Соотношение остаточных сигналов однозначно показывает, в каких точках дуплексы были полностью комплементарными, несмотря на то, что один из мисматчей - краевой ОТ, весьма устойчив.П р и м е р 3. Повышение чувствительности, точности и воспроизводимости предлагаемого способа и устройства подтверждается следующим примером,Подготавливалась олигонуклеотидная матрица, как в примере 1,Для гибридизации были использованы фрагменты с флуоресцентной меткой тетраметилродамином-ТМР на 3 -конце, вводимой с помощью терминальной полинуклеотидтрансферазы, Сравнение соответствующих кривых отмывки показало, что ТМР не влияет на устойчивость дуплекса,Использование флуоресцентной метки позволило проводить гибридизацию в микромасштабе. На фиг.7 представлены микрофотографии фрагмента микроматрицы, на которой октануклеотид 5 ф -б(ООССОТСО) иммобилизован в квадратиках геля со стороной 100 мкм. Такие микроматрицы мы будем называть "гибридизационными чипами". Как видно на фиг,7, позиция а, гибридизация с таким "чипом" позволяет весьма надежно детектировать замены отдельных оснований в последовательности (на фиг.7 в квадратик 1 правильный дуплекс квадратики 2, 3 и 4 дуплексы с мисматчами ОА, ОТ и СС, соответственно 3).Поскольку распределение флуоресцентной метки может быть измерено с очень высокой чувствительностью и пространственным разрешением, например, при помощи микроскопа, то предел обнаружения гибридизационного сигнала определяется только отношением сигнал/фон и не зависит от размеров объекта, интенсивность флуоресценции которого измеряется, Следовательно, чувствительность обратно пропорциональна площади объекта, т.е. ячейки олигонуклеотидной матрицы в нашем случае. Действительно, миниатюризация матрицы позволила очень сильно повысить чувствительность способа. Так, квадратики, изображенные на фиг,7, позиция г, содержат соответственно 1 фмоль, 100 амоль и 10 амоль тетраметилродаминового производного дезоксиуридина. При этом отношение сигнал/фон для квадратика г 3 равно 2, что достаточно для надежного определения количества вещества. Результаты модельных экспериментов, показывают принципиальную возможность анализа последовательности ДНК путем гибридизации со стандартным набором олигонуклеотидных проб, иммобилизованных на одной пластинке (матрице). Метод позволяет однозначно отличать правильные дуплексы от содержащих одну неправильную пару, Использование "приведенных" матриц делает практическую процедуру простой и удобной, Применение флуоресцентной метки существенно упрощает процесс считывания информации. Наконец миниатюризация олигонуклеотидной матрицы, а в настоящее время получены "чипы" с размером квадратиков геля 25 х 25 мкм, позволит не только экономить олигонуклеотидный материал, что само по себе очень важно, но и автоматизировать как процедуру гибридизации и отмывки, так и считывание и анализ информации.Известно, что в мировой практике стоимость определения 1-ой пары нуклеотидов составляет 3-5 долларов. Основные преимущества предлагаемого способа(при соответствующей доработке известного аппаратурного обеспечения) по сравнению с мировыми аналогами заключается в более высокой производительности при более низкой стоимости за счет использования микраколичеств реагентов, а так же1794088 12 15 20 вследствие снижения трудоемкости за счет возможности автоматизации всех процессов.На известных мировых аналогах (к примеру, на модели секвинатора ТЕ 2000 фирмы "НоеГег Ясеп 1 Юспвтговеп 1 в", США) цикл определения последовательности ДНК длиной 500 пар нуклеотидов составляет 22 ч. Из них 6 ч затрачивается непосредственно на секвенирование и 16 ч на радиоавтографию и расшифровку. Количества используемых реагентов измеряются в граммах. Формула изобретения 1; Способ определения нуклеотидной последовательности ДНК, включающий нанесение на стеклянную подложку набора олигонуклеотидов, проведение гибридизации с меченной тестируемой ДНК, отмывку при температуре плавления дуплексов, определение одиночных замен оснований в тестируемой ДНК по анализу распределения метки, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения достоверности способа, упрощения определения известных точечных мутаций в нуклеотидной последовательности. на стеклянной .подложке Другие известные аналоги обеспечивают примерно такую же производительность, Отличие состоит лишь в объеме сервиса, представляемого пользователю.5 Предлагаемый способ и устройство могут обеспечить производительность в 400 раз большую при одновременном сокращении рутинного труда пользователя. При этом количества основных реагентов изме ряется в микрограммах.Важно отметить, что в предлагаемомспособе в основном используется не радиоактивная, а флуоресцентная метка. предварительно формируют матрицу из геля-носителя, а гибридизацию и отмывку проводят при одинаковой температуре,2. Устройство для определения нуклеотидной последовательности ДНК, включающее стеклянную подложку и матрицу, о т л ич а ю щ е е с я тем, что, с целью повышения достоверности определения нуклеотидной последовательности, матрица представляет собой одинаковые участки геля толщиной 10-30 мкм и наибольшей длиной 25 - 100 мкм с расстоянием между участками, равным удвоенной наибольшей длине.1794088 Тепловая диссоциация совершенных дуплексов и дуплексов, содержащих одиночные мисматчиф;(ю, с) СТООССОТ3 в -ТОАССООСАО(36+0,5) фДанные усреднены по трем измерениям.ффПонижение температуры отмывки дефектного дуплекса по сравнению с совершенным,П р и м е ч а н и с, Мисматчи выделены жирным шрифтом, М -.матрица, символ д для удобстваопущен. Правильный дуплекс (т, с) М ОТСОТТТТ У - - ОСАО СААААТ(28+0,5)Мисматч ОА Фд 1 С)ГМТСОТТТТ УО АОСААААТА(-37) ГСТООС ОТ УТОАССО САОСОТСОТТТТ3-ТСАССООСАОСААААТО О О О 10 Ько, С иг. 10 10 20 емперап ур 0 50 4:МЫЬК 1.1, С емперап ура ощ фООССОТСОАССООСАОСАЛАЛ ООССОТСОАССОГСЛОСАЛААТГ

Смотреть

Заявка

4919321, 18.03.1991

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

ХРАПКО КОНСТАНТИН РАДИЕВИЧ, ХОРЛИН АЛЕКСАНДР АНАТОЛЬЕВИЧ, ИВАНОВ ИГОРЬ БОРИСОВИЧ, ЕРШОВ ГЕННАДИЙ МОИСЕЕВИЧ, ЛЫСОВ ЮРИЙ ПЕТРОВИЧ, ФЛОРЕНТЬЕВ ВЛАДИМИР ЛЕОНИДОВИЧ, МИРЗАБЕКОВ АНДРЕЙ ДАРЬЕВИЧ

МПК / Метки

МПК: C12N 15/00, C12Q 1/68

Метки: днк, нуклеотидной, последовательности

Опубликовано: 07.02.1993

Код ссылки

<a href="https://patents.su/11-1794088-sposob-opredeleniya-nukleotidnojj-posledovatelnosti-dnk-i-ustrojjstvo-dlya-ego-osushhestvleniya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ определения нуклеотидной последовательности днк и устройство для его осуществления</a>

Похожие патенты