Способ определения патулина в пищевых продуктах

СОЮЗ СОВЕТСКИХшаееювкиижРЕСПУБЛИК за, С О 1 И ЗЗ/02 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ 4 ОБРЕТЕНЕЛЬСТВУ В 26 Макс тель 1 шейЬодв ог Ед,СЬаргег,айгцп 8, 198 ПАТУЛИНА триваюцетатом,лоночнойтонкоеме то равьиатограраствопатулин ПИСАНИЕ И ВТОРСНОМУ СВИДЕ(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ, предусм щий экстракцию образца этил очистку экстракта методом к хроматографии ча силикагеле слойную хроматографию в сис луол-этилацетат - 85%-ная му ная кислота, проявление хрофической пластинки хлоромом бензидина и обнаружение 80110314 А в ультрафиолетовом свете с последующим. его количественным определением,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения чувствительности.и достоверности анализа, перед экстракцией этилацетатом в образец ввОдят 0,1-0,2% аскорбиновой кислоты,подвергают его диализу против 8-12%водного раствора хлористого натрия,а перед очисткой экстракта последнийсорбируют на силикагеле и очисткуведут путем последовательного элюирования толуолом и смесью гексанэтилацетата в соотношении 2:3-2:3,5, приэтом из тонкослойной хроматографиииспользуют двумерную в системах хлороформ-ацетон"85%-ная муравьинаякислота и толуол-этилацетат%-наямуравьиная кислота в обьемных соотношениях соответственно 78-82: 14-16:4-6 и 48-52:38-42:8-12, а хроматографическую пластинку после проявления фиксируют парафином.1103146 оставитель Л.Пехред М,Тепер и ректор О.Тиго едактор В.Ковт Заказ 4971/3 ПИ тни наб., д. 4/5 1130 лиал ППП "Патент", г.ужгород, ул,Проектная,Тираж 823 Государственного комите елам изобретений и откр Москва, Ж, Раушская Подписа СССР1103146 1Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано при анализе пищевых продуктов на содержание микотоксина патулина,Известен способ определения патулина в яблочном соке, предусматривающий экстракцию патулина из образца этилацетатом, очистку экстракта на колонке с силикагелем смесью бензолэтил-ацетат (3:1), отделение патули на от примесей с помощью одномерной тонкослойной хроматографии на силикагеле и обнаружение патулина по флуоресценции в длинноволновом ультрафиолетовом счете после опрыскивания 15 пластинки 3-метил-бензотиазолиноном 11 .Наиболее близким к предлагаемому является способ определения патулинав пищевых продуктах, предусматривающий экстракцию образца этилацетатом, очистку экстракта методом колоночной хроматографии на силикагеле, тонкослойную хроматографию в системе толуол - этилацетат%-ная муравьинаякислота, проявление хроматографической пластинки хлором и раствором бензидина и обнаружение патулина в ультрафиолетовом свете с последующим егоколичественным определением 2Недостатками известных способов являются образование трудноразделяемых эмульсий при экстракции образцов этилацетатов, вследствие чего возникает необходимость введения допол 35 нительной стадии центрифугирования, резкое нарастание количества мешающих определению патулина примесей в исследуемых образцах сока после их разгерметизации, недостаточная очистка экстракта на колонке от малополярных липидных компонентов, значительно повышающих массу пробы, наносимой на хроматографическую пластинку, недостаточное разделение патулина и других экстрагируемых веществ (мешающие примеси) в условиях одномерной тонкослойной хроматографии, часто приводящее к невозможности обнаружения и идентификации патулина, от 50 носительно высокая вероятность получения ложноположительных результатов вследствие наличия в экстрактах веществ, близких по хроматографическим ифлуоресцентным свойствам к патули 55 ну, неразделяемых в условиях одномерной тонкослойной хроматографии.Цель изобретения - повышение чувствительности и достоверности анализа,Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу определения патулина в пищевых продуктах,предусматривающему экстракцию образца этилацетатом, очистку экстрактаметодом колоночной хроматографии насиликагеле, тонкослойную хроматографию в системе толуол-этилацетат%-ная муравьиная кислота, проявление хроматографической пластинкихлором и раствором бензидина и обнаружение патулина в ультрафиолетовомсвете с последующим его количественным определением, перед экстракциейэтилацетатом в образец вводят 0,10,2% аскорбиновой кислоты, подвергают его диализу против 8-12% водногораствора хлористого натрия, а передочисткой экстракта последний сорби-руют на снликагеле и очистку ведутпутем последовательного элюированиятолуолом и смесью гексанэтилацетитав соотношении 2:3-2:3,5, при этомиз тонкослойной хроматографии используют двумерную в системах хлороформ- -ацетон%-ная муравьиная кислотаи толуол-этилацетат%-ная муравьиная кислота в объемных соотношенияхсоответственно 78-82:14-16:4-6и 48-52:38-42:8-12, а хроматографическую пластинку после проявления фиксируют парафином.На чертеже представлена пластинка,на которой проводят обнаружение и индентификацию патулина.Способ осуществляется следующим образом. К исследуемому образцу добавляют аскорбиновую кислоту в количестве 0,1-0,2% и выливают в целлофановый мешочек для диализа. Закреппяют мешочек в плоскодонной конической колбе, в которую предварительно помещают 8-12% водного раствора хлористого натрия и встряхивают содержимое колбы в течение трех часов. Затем диализный мешочек извлекают из колбы, водный раствор хлористого натрия (диализат) переносят в делительную волонку и экстрагируют этилацетатом. Этилацетатный экстракт сушат безводным сульфатом натрия, фильтруют в колбу, куда добавляют силикагель, и упаривают досуха (до консистенции пересыпающегося сухого порошка силикагеля) на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 С, Затем экстракт очищаютоз 1103 с помощью колоночной хроматографии. На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, наливают суспензию силикагеля в толуоле, Толуолу дают стечь, затем добавляют порцию толуолаи засыпают в колонку силикагель с адсорбированным экстрактом. Колонку с нанесенным экстрактом промывают толуолом, патулин элюируют смесью гексан-этилацетата в соотношении 10 2:3-2:3,5. Элюат упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 С.Обнаружение и индентификацию патулина проводят с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на пластинках "Силуфол". Для качественного определения пластинку размечают как показано на фиг.1 а. В точку на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят определенную эликвоту упаренного экстракта. В точки В и С 1 на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят стандартный раствор патулина, Пластинку помещают в камеру 25 для тонкослойной хроматографии, в которую предварительно наливают смесь хлороформ-ацетон-ная муравьиная кислота в объемных отношениях 78-82: 14-16:4-6. Развитие хрома 30 тограммы проводят в первом направлении до достижения фронтом растворителя карандагной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки, затем пластинку извлекают из камеры и сушат 5 мин на воздухе. Высушенную35 пластинку поворачивают на 90 по часовой стрелке и помещают в камеру для тонкослойной хроматографии ТСХ со второй системой растворителей толуол-этилацетат-ная муравьиная40 кислота в объемных соотношениях соответственно 48-52: 38-42; 8-12. Проводят развитие пластинки во в ром направлении. Затем высушенную от растворителя пластинку помещают в камеру с45 хлором. Атмосферу хлора в камере создают, смешивая растворы марганцевокислого калия и соляной кислоты. Проветрив от остатков хлора, пластинку опрыскивают раствором гидрохлорида бензидина в муравьиной кислоте, Через 20 мин пластинку фиксируют в парафине, т.е. опускают на 1 с в парафин, расплавленный при 40-60 С, парафину дают стечь, Пластинку рассматривают в длйнноволновом ультрафиолетовом свете (лапма ОЛДили прибор для флуоресцентного анализа витаминов, мо Ч, шС = -мкг/л (мкг/кг)Ч. Чконцентрация патулина в соке или пюре, мкг/л (мкг/кг),объем очищенного раствораэкстракта в этилацетатеперед ТСХ, мкл,объем раствора экстракта,наносимый на пластинку, мкл;объем сока (вес пюре),взятого для анализа, мл (г);количество патулина в пятнеэкстракта на пластине ТСХ,нг,м е р 1. Анализ яблочногомякоти (по предлагаемому где С МДля анализа берут 20 мл сока, добавляют 20 мг аскорбиновой кислоты, вылива,т в целлофановый мешочек для диализа, приготовленный из листа целлофана размером 30 х 30 см. Закрепляют мешочек в плоскодонной конической колбе на 250 мл, в которую предварительно добавляют 200 мл 10%-ного водного раствора хлористого натрия. Колбу встряхивают в течение 4 ч на аппарате для встряхивания проб. Мешочек извлекают из колбы, водный раствор хлористого натрия переносят в дели- тельную воронку на 500 мл, добавляют 100 мл этилацетата. Встряхивают, после разделения слоев верхний этилацетатный раствор отделяют. Нижний водный слой экстрагируют этилацетатом (3 50 мл). Соединенные этилацетатные 146 4дель 833) . Патулин проявляется в виде пятен с желтой флуоресценцией. Обнаружение на пластинке пятна патулина, соответствующего по цвету флуоресценции и по хроматографической подвижности пятнам стандарта патулина, свидетельствует о наличии патулина в анализируемом продукте. Для количественного определения экстракт наносят на пластинку, размеченную,как показано на фиг. 1 б В точки С, С 2, С наносят разные количества стандартного раствора патулина, в точку В также наносят стандартный раствор патулина. После проведения двумерной ТСХ, проявления пластинки и обнаружения пятен патулина, сравнивая флуоресценцию разных количеств стандарта патулина с интенсивностью флуоресценции пятна патулина в экстракте, расчитывают содержание патулина в еоке или пюре по формуле:12). После развития пластинки вовтором направлении пластинку сушатна воздухе до полного исчезновениязапаха растворителя. Для обнаруженияпятен патулина пластинку помещают вкамеру с хлором на 15-20 мин. Атмосферу хлора в камере создают, помешая в камеру химический стакан, вкотором смешивают 50 мл 5 Е-ного водного раствора марганцевокислого калия и 50 мл 257-ной соляной кислоты.После извлечения пластинки из камерыс хлором ее оставляют в вытяжномшкафу до полного удаления хлора спластинки. Затем пластинку опрыскивают 0,57-ным раствором гидрохлорида бензидина в 853-ной муравьиной кислоте. Через 20 мин пластинку опускают на 1 с в расплавленный при57 С парафин, парафину дают стечь.После фиксации пластинку рассматривают в длинноволновом Уф-свете. Напластинке обнаруживается пятно сжелтой флуоресценцией, находящеесяна пересечении . перпендикуляровк направлениям развития хроматограммы, проведенных из пятен стандартовпатулина, Сравнивая интенсивностьфлуоресценции разных количеств стандарта патулина с интенсивностью пятна патулина в экстракте, определяют,что пятно экстракта соответствует2 мкл стандартного раствора с концентрацией 5 мкг/мл т,е. 10 нг. Расчетконцентрации патулина в соке: Ч ш 200 10С = --- -= --- = 10 мкг/л,Ч 2,Ч 1020Таким образом, в данном яблочном соке содержится 10 мкг патулина.П р и м е р 2, Анализ яблочного сока беэ мякоти (по известному способу). 50 мл яблочного сока из той же партии, что и в примере 1, экстрагируют в делительной воронке 3 раза по 30 мл этилацетата. Объединенные этилацетатные экстракты сушат 1 ч 5 г безводного сернокислого натрия. Высушенный раствор фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты и упаривают на ротационном испарителе до объема 2 мл. Затем экстракт наносят на хроматографическую колонку, приготовленную следующим образом: в стеклянную колонку диаметром 25 мм помещают слоями 8 г сипикагеля и из него 15 г безводного сернокислого натрия. Колонку элюируют 50 мл этил 5 1103146экстракты сушат сернокислым натрием(10 г) в течение 1 ч, Сухой этилацетатный раствор Фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в круглодонную колбу на 500 мл. Сернокислый натрий промывают 25 мл свежейпорции этилацетата и отфильтровываютв ту же колбу. Добавляют 1 г силикагеля и упаривают до консистенции сухого пересыпающегося порошка силикаге Оля на ротационном испарителе при темопературе водяной бани не выше 40 С.Для очистки экстракта с помощьюколоночной хроматографии на дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, наливают суспензию 2 г (4 мл)в 20 мл толуола. Толуолу дают стечь, затем, не допуская просыхания колонки добавляют 20 мл толуола и высыпа 1ют в колонку силикагель с адсорбиро ванным экстрактом из круглодонной колбы. Дают толуолу стечь и элюируют колонку 100 мл толуола. Толуольные элюаты отбрасывают. Круглодоннуюколбу споласкивают 5 мл смеси гексан -этилацетат (2;3) и выпивают раствор в колонку, добавляют 100 мл смесигексан-этилацетат (2:3), Элюат упаривают в грушевидной колбе на 100 млна ротационном испарителе до объема примерно 0,2 мл при температуре не вы. ше 40 С. Полученный раствор анализируют с помощью двумерной тонкослойной хроматографии, т.е. определяют качественное и количественное содержание патулина. Для этого пластинку "Силуфол" размером 15 Х 15 см размечают тонкими карандашными линиями (Фиг. 1 б). В точку А на расстоянии 1,5 см от краев пластинки с помощью микрошприца наносят 10 мкл из 200 мкл (0,2 мл) экстракта. В точку В наносят 3 мкл, а в точки С 1, С, С 2 4 и 6 мкл стандартного раствора1патулина с концентрацией 5 мкг/мл соответственно, Пластинку помещаютыфв камеру для тонкослойной хроматографии со смесью хлороФорм-ацетон- -85%-ная муравьиная кислота в объемном соотношении 16:3:1. Развитие хроматограммы проводят в первом направлении до достижения фронтом растворителя карандашной линии. Пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе 5 мин. Высушенную пластинкуо 5 поворачивают на 90 по часовой стрел. ке и помещают в камеру для ТСХ со смесью толуол-этилацетат-ная муравьиная кислота (5:4:1) или (50:38:ацетата. Элюат упаривают на ротационном испарителе до объема примерно 1 мл. Наносят с помощью микрошприца 10 мкл полученного раствора в этилацетате на пластинку "Силуфол", на ту же пластинку наносят 2, 5 и 10 мкл стандартного раствора патулина с концентрацией 10 мкг/мл. Пластинку помещают в камеру для тонкослойной хроматографии со смесью то луол-этилацетат-ная муравьиная кислота (5:4: 1). Затем пластинку извлекают сушат. Пластинку обрабатывают хлором, раствором бензидина или о-дианизидина в 857.-ной муравьиной 15 кислоте, так как это было описано в примере 1 (без фиксации пятен парафином).Стандарты патулина проявляются в виде пятен с желтой флуоресценцией. 20 В экстракте на уровне патулина есть слабо-желтая флуоресценция, почти не различимая из-за наложения фоновой флуоресценции неотделенных мешающих веществ. Сделать надежного заключе ния о наличии патулина и оценить его количество невозможно.П р и м е р 3. Анализ яблочного пюре (по предлагаемому способу).Взвешивают 10 г пюре, разбавляют ЗО дистиллированной водой до объема 20 мл, тщательно перемешивают. Далее проводят анализ так, как описано в примере 1, только соотношение компонентов в смеси хлороформ-ацетонХ 35 ная муравьиная кислота 80:15:5, а в смеси толуол-этилацетатХ-ная муравьиная кислота 48:42:10. После проявления хроматографической пластинки бензидином обнаруживают, что 4 б интенсивность флуоресценции пятна патулина в экстракте соответствует интенсивности флуоресценции 2 мкл стандартного раствора патулина с концентрацией 5 мкг/мл, т.е, 10 нг. 4 Расчет концентрации патулина в пюре:20010С = ---= 20 мкг/кг,1010где Ч - 200 мкл, Ч - 10 мкл; ш - 10 нг; Ч - 10 г.50Таким образом, в исследуемом яблочном пюре обнаружено 20 мкг/кг патулина.П р и м е р 4. Анализ яблока (по предлагаемому методу). 55Для анализа берут яблоко, пораженное так называемой зеленой гнилью (на оболочке наблюдаются светло-коричневые изменения, местами на фруктовой мякоти возникают бело-серые валики плесени). Яблоко натирают на мелкой терке, полученную массу пюре смешивают, отбирают пробу для анализа (10 г), разбавляют дистиллированной водой до объема 20 мл и анализируют,как описано в примере 1. При проведении тонкослойной хроматографии эликвоту экстракта, наносимую на хроматографическую пластинку; уменьшают до 10 мкл из 500 мкл (0,5 мл). После проявления пластинки бензидином интенсивность пятна патулина в экстракте соответствует интенсивности 4 мкл стандартного раствора патулина с концентрацией 5, мкг/мл, т,е. в пятне содержится 20 нг патулина,Расчет концентрации патулина в яблоке:500 20С = ---- = 100 мкг/кг10 10Эгде У - 500 мкл, Ч - 10 мкл, ш - 20 кг; Ч=10 г.Анализ приведенных примеров показывает, что способ-прототип (пример 2) не дает возможности определить патулин на уровне 10 мкг/кг.В то же время использование аскорбиновой кислоты в качестве энтиоксиданта и ингибитора роста микрофлоры, диализ, колоночная и тонкослойная хроматография с описанными нововведениями, приводит к повышению чувствительности предлагаемого способа почти в 2 раза. При изучении хроматографической пластинки в .ультрафиолетовом свете пятно патулина, обладающее желтой флуоресценцией, четко различимо. Отсутствует наложение примесей на пятно патулина, в связи с чем не возникает затруднений в его качественном и количественном определении.Примеры 3 и 4 иллюстрируют универсальность предлагаемого способа, позволяющего определять патулин в любых видах продуктов, независимо от их консистенции. Чувствительность метода также составляет 5-10 мкг/кг. Для определения достоверности предлагаемого способа проводится анализ по предлагаемому способу и способу прототипу яблочного пюре, искусственно загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг, соответствующем пределу обнаружения способа-прототипа и предельно допустимой концентрации1103 Таблица 1 Порядковый номер пробы и показатели 12 50 16 16 30 20 20 н 20 20 н 20 н 24 28 10 патулина в детском и диетическомпитании, установленном в ряде зарубежных стран. Исследуемые образцыпищевых продуктов до добавления вних патулина были проанализированына содержание патулина. Результатыпоказывают полное отсутствие естественного загрязнения обр,"цов патулином,П р и м е р 5. Анализ яблочного 1 Опюре, загрязненного патулином науровне 20 мкг/кг по предлагаемомуспособу.К .1 О пробам по 10 г каждая яблочного пюре, взятым из одной банки, 15добавляют патулин на уровне 20 мкг/кги параллельно проводят анализ в соответствии с примером 3. На хроматографическую пластинку наносят 10 мклиз 400 мкл очищенного экстракта. После проявления пластинок визуальноопределяют количество патулина в аликвоте экстракта .на пластинке, сравнивая со стандартом патулина, нанесенным на ту же пластинку. В 10 параллельных пробах на пластинкаХ обнаруживают следующие количества; 3, 4,4, 5, 5, 5, 5, 5, 6, 7 нг. Расчетконцентрации патулина в образцах проводят по формуле 30 400 мклмС =- ------ = 4 ммкг/кг,100 мкл 1 О гм = 3 нг, С = 12 мкг/кг;м = 4 нг, С = 16 мкг/кг;м = 5 кг, С = 20 мкг/кг; 35м = 6 кг, С = 24 мкг/кг;.м = 7 кг, С = 28 мкг/кг.Таким образом, из 10 исследованных проб яблочного пюре, загрязненно-. го патулином на уровне 20 мкг/кг, в 40 5 пробах обнаружено 20 мкг/кг, в 2 16 мкг/кг, в 1 - 12 мкг/кг, в 1 24 мкг/кг, в 1 - 28 мкг/кг.П р и м е р 6. Анализ яблочного45 пюре, загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг по способу-прототипу.Для анализа берут 10 проб по 20 г каждая яблочного пюре из той же банки, что и в примере 5, добавляют патулин на уровне 20 мкг/кг и параллельЖ но анализируют в соответствии с Примером 2. На хроматографическую пластинку наносят 10 мкл из 1 мл очищенного экстракта. Большую аликвоту нанести не удается из-за большой мас сы экстракта. После проявления пластинок в соответствии со способом-про тотцпом визуально определяют количе 146 10ство патулина на пластинке в экстракте, сравнивая со стандартом, нанесенным на ту же пластинку. Обнаруживают,что сделать надежного заключения оналичии патулина в экстрактах и оценить его количество невозможно в7 пробах из-за наложения пятен сжелто-коричневой флуоресценцией. В3 пробах патулин обнаружен, визуально оценено его количество на пластинке: 10, 4 и 5 нг, Из расчета концентрации патулина в пюре установлено,что прим = 10 нг, С = 50 мкг/кг,м = 4 кг, С = 20 мкг/кгм = 5 нг С = 25 мкг/кг,Таким образом, из 10 исследованных проб яблочного пюре, загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг, патулин достоверно обнаружен в 3 пробах, из них результат завышен в 2,5 раза в одной пробе, в 1,25 раза в другой, и только в одной пробе количество обнаруженного патулина соответствует внесенному количеству.Результаты анализов яблочного пкре, загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг, проведенных по способу прототипу и предлагаемому способу1103146 12 Продолжение табл . Порядковый номер пробы и пока 1 эатели Среднее отклонение,мкг/кг О 13,30 2,96 Стандартноеотклонение,мкг/кг 17,07 3,60 Относительное стандартноеотклонение, 7 179,6 18,3 20 Доверительныеграницы длясреднегозначения,мкг/кг 9,512,2 19,6+2,5 Коэффициентвариации 1,28 0,13 ЗО чественного Обнаруженное количествопатулина, мкг/кг по способу 5 Известный Предлагаемый П р и м е ч а н и е, н - невозможность идентификации и колиопределенияпатулина.Статистическая обработка результатов анализов показывает, что среднее значение обнаруженного количества патулина при анализе способом-прототипом занижено на 52,57 против дей 40 ствительного, при этом вариабельность результатов 1287, что свидетельствует о недостоверности способа-прототипа (р0,1). Предлагаемый способ дает достоверные результаты (р ( 0,05)45 при вариабельности 137. При этом среднее значение полученных результатов отличается от действительного на 27.Выбранный интервал аскорбиновой кислоты 0,1-0,27.является оптимальным. Добавление меньшего количества аскорбиновой кислоты влечет за собой ускоренныйрост загрязнения аналитической пробы продуктами, затрудняющи ми хроматографическое определение патулина. Превышение уровня (0,27 количества аскорбиновой кислоты) не улучшает качество анализа пищевого продукта по сравнению с выбранным интервалом (0,1-0,27) и поэтому нецелесообразно. Кроме того, более высокие концентрации аскорбиновой кислоты (порядка 57) при добавлении к яблочному соку приводят к полному разрушению патулина, содержащегося в образце в количестве 300 мкг/кг на 17-й день хранения.П р и м е р 7. Анализ образца яблочного сока, загрязненного патулином на уровне 100 мкг/кг, по предлагаемому способу с добавкой аскорбиновой кислоты на уровне 0,027.К 20 мл яблочного сока, загрязненного патулином на уровне 100 мкг/л, добавляют 4 мг аскорбиновой кислоты. Анализ проводят аналогично примеру 1. Получают хроматограмму, представленную на фиг. 1 а, откуда видно, что флуоресцирующие в длинноволновом ультрафиолетовом свете примеси закрывают хроматографическое поле и не дают возможность обнаружить патулин в экстракте после соответствующего проявления. Для сравнения на фиг,1 б приведена хроматограмма, полученная в результате анализа, .рассмотренного в,примере 1. Использование 8-127.-ного водного раствора хлористого натрия при диализе имеет целью создание более высокого осмотического давления во внешнем диализном пространстве, что обеспечивает нужное направление процесса диализа. Использование более низких чем 87-ных концентраций раствора хлористого натрия может приводит к разбавлению образца внутри диалиэного мешка и связанным с этим потерям патулина. При концентрации хлористого натрия выше 127 происходит повышен-, ная диффузия воды из диализного мешочка, что приводит к заметному увеличению вязкости анализируемого образца и снижению скорости диффузии, патулина во внешнее диализное прост- ранство, снижению извлечения патулина из образца. П р и м е р 8. Анализ нектара "Свежесть", загрязненного патулином на уровне 100 мкг/кг, по предложенному способу при концентрации хлористого натрия в воде во внешнем диализном пространстве 3, 8, 10, 12 и 177,13 110 314 Ь 14 Продолжение табл .2 Показатели Объем раствора во.внешнем диализном Таблица 2 Показатели Объем раствора войнешнем диализ нам 55 Для анализа берут 5 проб по 20 мл нектора, представляющего собой смесь яблочного и морковного соков с мякотью, добавляют патулин на уровне 100 мкг/л. Анализ проводят аналогич но примеру 1. Исключение составляет стадия диалиэа, где во внешнем диализном пространстве используют водный раствор хлористого натрия 3, 8, 1 О; 12, 173. После стадии .диализа замеряют объем диализата (табл, 2). На хроматографическую пластинку наносят 10 мкл из 2000 мкл. Сравнивая с различными количествами стандарта патулина, в каждом иэ 5 экстак тов определяют 7 нг для ЗХ-ного раствора хлористого натрия, 9 нг для 8 Ж-ного, 10 нг для 103-ного, 9 нг для 123-ного, 8 йг для 177.-ного, Расчет концентрации патулина в образце 20 проводят о формуле 2000 мкл 7 нг(17 Ж) С -------- 80 мкг/л, 35 10 мкл 20 мл Влияние концентрации раствора хлористого натрия во внешнем диализном пространстве на потери патулина при анализе предлагаемым способом показа 10 но в табл. 2. Исходная концентрацияраствора хлористого натрия во внешнем диализномпространстве, 7 3 8 10 12 17 пространстведо диализа,мл 200 200 200 200 200 Исходная концентрацияраствора хлористого натрия во внешнем диализномпространстве,7 3 8 10 12 17 пространствепосле диалиэа, мл 185 195 200 195 190 Потери патулина при аназе, Ж 25 1 О 0 10 20 Из примера 8 видно, что потери патулина минимальны при предлагаемых. ,.онцентрациях раствора хлористого натрия во внешнем диализном простран стве.П р и м е р 9. Анализ образца нектата "Свежесть", загрязненного патулином на уровне 20 мкг/л, по предложенному способу за исключением соотношения растворителей для КХ, злюирущих патулин с колонки.Для анализа берут 2 пробы по 20 мл нектара, добавляют патулин на уровне 20 мкг/л. Анализ проводят аналогично примеру 1 за исключением соотношения растворителей для элюирования патулиновой фракции с колонки: для пробы У 1 используют систему гексанэтилацетат (2;2), для пробы В 2 - гексан-этилацетат (2:4,5), т.е. варьируют количество этилацетата в системе относительно граничных значений. На ТСХ пластинку наносят 0,5- 3 мкл стандартного раствора патулином с интервалом в 0,5 мкл и 10 мкл из 400 мкл очищенного экстракта. Пластинку проявляют и обнаруживают патулин в экстракте У 1 в количестве 5 нг на пластинке (интенсивность флуоресценции пятна патулина в экстракте соответсвует интенсивности флуоресценции 0,5 мкл стандартного раствора с концентрацией 10 нг/мкл). В образце В 1 обнаружено 400 мклф 5 нг----- 10 мкг/л10 мкл 20 мл,6 82: 16: но 15т.е. только 507 внесенного патулина. Экстракт 119 2 отличается большей массой после упаривания растворителя. Нанесение 10 мкл из 400 мкл затруднено, происходит пересыщение активного слоя силикагеля в точке нанесения экстракта, качество хроматографического отделения патулина от других компонентов экстракта резко снижается пятна не имеют округлой формы и чет ких очертаний, размазаны по хромато-.графическому полю. Это делает невозможным индентификацию и количественное определение патулина в экстракте, Из примера 9 видно, что при содер жанни этилацетата в системе ниже чем 32 гексана, патулин не полностьюэлюируется с хроматографической колонки, причем чем больше отклонениеот предлагаемого соотношения раство рителей, тем больше потери патулина, Увеличение содержания этилацетата в системе больше чем 2:3,5 приводит к увеличению полярности системы и наряду с патулином элюируется большое 25 количество прочих компонентов экстракта, значительно увеличивающих массу экстракта, что резко затрудняет проведение двумерной ТСХ. Соблюдение при КХ границ предлагаемого соотношения гексан-этилацетат позволяет практически полностью смывать с колонки патулин, оставляя на старте большую часть примесей.В системе растворителей при дву 35 мерной ТСХ изучена хроматографичес. кая подвижность патулина и других компонентов экстракта яблочного пюре в предложенных системах хлороформ-ацетон-ная муравьиная кислота и толуоя -этилацетат.-ная муравьиная кислота при граничных и средних значениях концен траций растворителей в с: темах.В табл. 3 представлена хроматографическая подвижность патулина в изу чаемых системах растворителей.Таблица 3 Критерием оптимальности хроматографирования вещества в тонком слое являются нахождение пятна патулина в интервале И между 0,35 и 0,65, а также правильная форма и четкие границы пятна, отсутствие наложения близких к патулину по флуоресцентным свойствам компонентов экстракта. Отмечено, что в системе 1 значение КГ патулина находится на верхней границе указанного интервала и дальнейшее увеличение концентрации полярных компонентов в системе приводит к превышению КГ значения 0,65 и.,следовательно,к ухудшению качества ТСХ (фиг. За), Система 4 имеет тенденцию расслаиваться, хотя значение К 1 патулина удовлетворяет оптимальным условиям ТСХ, Системы 3 и 6 представляют собой граничный случай, когда дальнейшее уменьшение содержания полярных компонентов .в системе приводит к снижению И с 0,35 и ухудшению качества ТСХ (фиг. Зб). Только промежуточные соотношения компонентов (системы 2 и 5) позволяют максимально отделить пятно патулина от пятен других компонентов экстракта, пятна соединений имеют округлую форму, четко очерчены, О, 35 ( КГ0,65, т. е.соблюдаются правила качественного проведения ТСХ, обеспечивающие возмож" ность безошибочного обнаружения, индентификации и количественного определения патулина в экстрактах пищевых продуктов. ким образом, предлагаемый споозволяет повысить чувствительи достоверность анализа.