Способ количественного определения суммы антоцианинов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 4647 А 31 51)5 6 ЗОБ Т И ПИСАН И Изобретение о мышленности, сель быть использовано чества антоцианин растений, пищевь красителях, в сель а также для оценк сти некоторых пло селекции по этомуЦель изобрете щевой прову и может ится к и ухозяй ом ения колиных частях , пищевых ном сырье, й активноул ьтур и их дл ов определ различдук скохо и Р-ви до во-я приз ния -яиствен таминно днь)хКу.овыш ние точн сти.При осустракцию аматериаларастворитеванная солнии 10-12:1100-110 С,органическту органич ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) Муравьева Д,А., Бубенчикова В.Н., Беликов Н,В. Спектрофотометрическое определение суммы антоцианинов в цветахвасилька синего. - Фармакология, 1987, т.36, М 5, с. 28-29,(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ АНТОЦИАНИНОВ(57) Изобретение относится к пищевой промышленности, сельскому хозяйству и можетбыть использовано для определения колиществлении данного способа экнтоцианинов из растительного проводят двухфазной системой лей петанол- концентрирояная кислота - вода в соотноше-12:2-4 в течение 10-25 мин при охлаждают экстракт, отделяют ую фазу, Затем отбирают аликвоеской фазы и измеряют оптичечества антоцианинов в различных частях растений, пищевых продуктах, пищевых красителях, в сельскохозяйственном сырье, а также для оценки Р-витаминной активности некоторых плодово-ягодных культур и их селекции по этому признаку, Экстракцию антоцианинов из растительного материала проводят двухфазной системой растворителей пентанол- концентрированная соляная кислота - вода в соотношении 10-12:10-12:2-4 при температуре 100-110 С в течение 10-25 мин. Суммарное количество антоцианинов вычисляют по разности оптических плотностей при длинах волн 530 и 655 нм до и после обработки органической фазы экстрагента смесью 30-ного пероксида водорода и метанола. 1 ил., 11 табл. скую плотность при длинах волн 530 и 655 нм относительно пентанола. После этого к аликвоте добавляют смесь метанола и 30;- ного пероксида водорода в соотношении 2,5-2,0:1,5-2,0 так, чтобы на 1 объемную часть аликвоты приходилось 1,5-4,0 объемных частей смеси, и через 20-25 мин вновь измеряют оптическую плотность на тех же длинах волн, Суммарную концентрацию антоцианинов рассчитывают по разности оптических плотностей,Для увеличения экстракционной способности экстрагента используется равновесная двухфазная система растворителей пентанол- концентрированная соляная кислота в смеси с водой. В "водном" слое, представляющем собой раствор соляной кислоты в воде, экстрагируемые из растительного материала антоцианины при нагревании гидролизуются до единойагликонной формы, Наличие в слое небольших количеств пентанолапонижает полярность водной фазы, что улучшает экстракцию антоцианинов. Образующиеся агликоны, хорошо растворимые в пентаноле, накапливаются в спиртовой фазе, Таким образом, спиртовый слой играет роль фазы- коллектора, который, поглощая антоцианины в агликонной форме, постоянно поддерживает водный слой в ненасыщенном состоянии, способствуя более глубокой экстракции и гидролизу антоцианинов,Высокая температура (100-110 С) и высокая концентрация соляной кислоты обеспечивают полный гидролиз антоцианинов до единой агликонной формы,Для предотвращения мешающего влияния компонентов (флавоны, флавонолы и халконы) проводят измерение оптической плотности при длине волны 530 нм до и после обработки смесью 30%-ного пероксида водорода и метанола (1,5-2,0:2,5-2,0) в течение 20-25 мин. При действии этой окислительной системы из всего разнообразия флавоноидных соединений разрушаются лишь антоцианины, поэтому при вычитании оптической плотности раствора до и после окисления величины, соответствующие поглощению мешающих флавонолов, становятся равными нулю.Влияние хлорофиллов, также мешающих определению антоцианинов, учитывается дополнительным измерением оптической плотности при длине волны 655 нм,На чертеже показана треугольная диаграмма Гиббса-Розебома зависимости выхода суммы антоцианинов от соотношения компонентов экстрагирующей смеси.П р и м е р 1. Плод, очищенный от косточек, гомогенизируют, отбирают 0,10- 0,25 г гомогената, помещают его в колбу емкостью 50-70 мл, заливают смесью 11 мл концентрированной соляной кислоты и 11 мл пентанола. Затем добавляют 3 мл воды и нагревают смесь с обратным холодильником на глицериновой или масляной бане при 100-110 С, изредка встряхивая содержимое колбы. Спустя 20 мин нагревание прекращают, колбу охлаждают, ее содержимое переносят в делительную воронку. Стенки колбы омывают 1-2 порциями пентанола(по 5 мл), который затем также переносят в делительную воронку. Органический (верхний) слой сливают в мерную колбу емкостью 50 мл, Водную фазу после разделения взбалтывают с 5-10 мл пентанола, отделяют его в воронке и объединяют с остальной органической фазой. Объем последней доводят пентанолом до 50 мл, отбирают аликвоту 3 мл и определяют ее оптическую плотность на длинах волн 530 и 655 нм. Если плоды 5 особенно богаты антоцианинами и однойэкстракции недостаточно для полного их извлечения, операцию экстрагирования проводят дважды, используя мерную колбу на 100 мл. Для проб, содержащих малые коли чества антоцианинов, отбор аликвоты следует проводить прямо из органического слоя экстрагента. Аналогичного эффекта можно достигнуть, используя для анализа соответственно меньшие или большие ис ходные навески гомогената,К взятой аликвоте добавляют 6 мл метанола, 6 мл 30%-ного пероксида водорода, раствор перемешивают и через 25 мин снова спектрофотометрируют, Расчет суммар ной концентрации антоцианинов проводятпо формуле О + ЧМ ант9Е ант25 А 530 - г А 530 х А 655 г А 6551 - хагде 0 - содержание суммы антоцианинов в пробе, мг/г или мг/мл;Ч - общий объем органической фазы(мерной колбы), мл;Мант - молекулярная масса стандартного антоцианина, на который ведут пересчет всех остальных веществ этой группы, г/моль;Еант - молярный коэффициент погашения стандартного антоцианина, л/моль см;г - разведение аликвоты (в примере каликвоте добавляют 6 мл метанола и 6 мл Н 202, Объем аликвоты до разбавления - 3 40 мл, после разбавления - 15 мл. Таким образом, г=15/3=5);ц - масса или объем пробы, г или мл; А 5 зо и А 655 - оптические плотности аликвоты на длинах волн 530 и 655 нм до добав ления метанола и Н 202;ьА 5 з 0 и А 655 - оптические плотности раствора спустя 20-25 мин после добавления метанола и Н 202;х и а - соотношения коэффициентов 50 погашения хлорофиллов (смеси хлорофиллов или стандартного хлорофилла и стандартного антоцианина на длинах волн 655 и 530 нм).Результаты анализа количества суммы 55 антоцианинов в плодахецизтгов чицагеприведены в табл.1, В качестве стандартного .антоцианина и внутреннего стандарта для проверки способа использован пелларгонидин. Выход внутреннего стандарта -97,8 ф , среднеквадратическая ошибка - 0,06-0,08, ошибка среднего - 1,6-2,7.Внутренний стандарт - 0,89 мг/г, Выход внутреннего стандарта - 0,87 мг/г ( 97,8).П р и м е р 2, 0,25 г травяной муки, полученной из люцерны, скошенной в фазе цветения (используют для кормления сельскохозяйственных животных) или 0,2 г измельченных лушпаек подсолнечника (используют как сырье для получения красного пищевого красителя) тщательно перемешивают с раствором НС и пентанолом, затем добавляют 3 мл воды и анализируют, как в примере 1. Полученный гидролизат имеет интенсивный желто-коричневый цвет из-за большого количества сопутствующих фенольных соединений. Если аликвота слишком сильно поглощает на длине волны 530 нм, ее разбавляют пентанолом в 2-3 раза, а полученную оптическую плотность умножают на величину разведения. Результаты определения приведены в табл.2.П р и м е р 3, 5,5 мг (5,5 х 10 г) неочищенного (до сбраживания и диализа) пищевого красителя заливают 11 мл пентанола; слегка нагревают и перемешивают до полного растворения, затем добавляют остальные компоненты смеси и проводят анализ, как в примере 1. Во время нагревания экстрагент каждые 2-3 мин тщательно перемешивают или встряхивают. Это необходимо для более полного контакта антоцианинов с раствором НС (более полного гидролиза), При слишком сильном поглощении антоцианинов либо разводят аликвоту, как в примере 2, либо повторяют весь анализ с меньшей навеской пигмента. Результаты измерения см. в табл.3.П р и м е р 4. К 22 мл смеси пентанолаи концентрированного раствора НС (11:11) приливают 3 мл виноградного напитка. Далее анализ проводят, как в примере 1. По мере гидролиза антоцианины переходят из водного слоя в органический. Время гидро- лиза - 10 мин, Количество антоцианинов в виноградном напитке приведено в табл.4П р и м е р 5. 0,2 г лепестков астры красноцветковой однолетней (Азтег авеиз) экстрагируют системами растворителей, содержащих различные соотношения пентанола, концентрированной соляной кислоты и воды, в течение 10 мин, Далее анализ проводят, как в примере 1. Количество пентанола и соляной кислоты варьируют от 36 до 52 , воды - от 4,5 до 25 ф . Максимальная концентрация антоцианинов (1,26 мг/г) получена при соотношении спирта, кислоты и воды 10-12;10-12:2-4, 55 личество антоцианинов извлекается при температуре среды 100-110 С. При 60-90 С скорость гидролиза и извлечение антоцианинов уменьшаются, при 120 С начинается полимеризация антоцианинов, поэтому Результаты подбора соотношения компонентов экстрагирующей системы растворителей приведены на треугольной диаграмме состава Гиббса-Розебома (см 5 чертеж). Изолинией "а" ограничена областсостава смеси, при которой достигается из влечение более 85 ф антоцианинов (точки 1 - 86,0 ; 2,3 - 88,4 ф ; 4 - 100,0; 5 - 88,6 ф 6 - 85,37 - 89,1 ; 8 - 95,3 ; 9 - 90,7 ) 10 Линия "б" отделяет область составов, прькоторых двухфазная система неустойчив; или не существует. Из диаграммы, изобра женной на чертеже следует, что при увели.чении количества спирта, соляной кислоты 15и при уменьшении количества воды разделение фаз ухудшается. Уменьшение в системе доли соляной кислоты или увеличение объема воды приводит к понижению общего содержания НС, что замедляет экстракцию 20 и ухудшает условия гидролиза. При уменьшении количества спирта соответственно уменьшается объем органической фазы, что вызывает снижение эффективной емкости экстрагента. Таким образом, оптимальным 25 является соотношение компонентов пентанол- конц. соляная кислота - вода - 10- 12:10-12:2-4. Отклонения от данного соотношения либо ухудшают условия экстракции, либо понижают устойчивость двух фазной системы.П р и м е р 6. 0,2 г лепестков астрыэкстрагируют системой растворителей пентанол- конц. соляная кислота - вода (11;11;3) в течение 5-35 мин. Результаты оп ределения суммарного количества антоцианинов приведены в табл.5 Максимальное извлечение наблюдается при продолжительности экстракции 10-25 мин, Большее время экстракции приводит к уменьшению 40 количества антоцианинов, по-видимому, изза реакции окислительной полимеризации, характерной для антоцианинов и протекающей в жестких условиях.П р и м е р 7. 0,2 г лепестков астры 45 однолетней заливают экстрагентом составапентанол- конц.соляная кислота - вода (11:11;3) и нагревают на термостатируемой бане в течение 15 мин при температурах 60-120 С. Отсчет времени начинают, когда 50 показания термометра, помещенного в экстрагент, достигают заданной температуры (60-100 С) или когда экстрагент начинает кипеть (110-120 С). Результаты, приведенные в табл.6, показывают, что максимальное ко 17446475 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 концентрация анализируемых веществ в экстракте понижается,П р и м е р 8. К 1 мл раствора пелларгонидина в пентаноле(С=2,6 х 10-5 М) приливают 4 мл смеси спирта и 30 -ного пероксида водорода, Количество раствора Н 202 в смеси варьируют от 6,25 до 50 объемных процентов, Добавление больших объемов Н 202 приводит к помутнению пробы за счет разделения фаз и образования эмульсии. Измерение оптической плотности проводят на автоматическом спектрофотометре каждые 100 с, Константу скорости реакции определяют методом наименьших квадратов по формулепАт=пАо-К7,где Ао - начальная оптическая плотность раствора (530 нм);К - константа скорости реакции, с;т - время протекания реакции, с;А у - оптическая плотность в данный момент времени,Зависимость скорости реакции от соотношения 30 -ного пероксида водорода и спирта, а также от химического строения последнего приведены в табл.7. Наибольшая скорость окисления наблюдается при добавлении к раствору антоцианинов смеси 30;4-ной Нг 02 и метанола в соотношении 1,5-2,0:2,5-2,0.П р и м е р 9. Аликвоты 0,5; 1,0; 1,5; 2,0;2,5; 3,0 мл раствора пелларгонидина (С=2,2 х 10 М) в пентанолесмешивают с окисляющей смесью 30 -ная Нг 02 - метанол (2:2) так, чтобы общий объем полученного раствора был равен 5 мл, Константы скорости реакции определяют, как в примере 2, Полученные результаты (табл.8) показывают, что наибольшая скорость окисления (распада) наблюдается при соотношении объемов аликвоты и окисляющей смеси 1:4-1:1,5.П р и м е р 10. К растворам пелларгонидина объемом 1 мл добавляют по 4 мл смеси 30 -ной Н 20 и метанола в соотношении 1,50:2,50; 1,75:1,25; 2,00:2,00, Измерения оптической плотности проводят каждые 3-5 мин, затем рассчитывают процент распада антоцианина, Результаты, приведенные в табл.9, показывают что распад более чем 99,0 фантоцианинов достигается при продолжительности реакции более 20 мин. В целях сокращения времени аналитического определения верхний предел. продолжительности реакции взят равным 25 мин, За 5 мин пробу подготавливают к спектрофотометрированию и определяют ее оптическую плотность при 530 и 655 нм. П р и м е р 11. Навески смеси фенольных соединений, выделенной из лепестков хризантемы корейской и содержащей флавонолы и антоцианины, растворяют в равных объемах 1 ф-ного водного раствора НС и пентанола. Определение оптической плотности проводят согласно предлагаемому способу и способу-прототипу. Затем к аналогичным растворам добавляют хроматографически очищенный спиртовый экстракт хлорофилла А в количестве 0,1 мл на 3 мл раствора антоцианинов и снова проводят анализ, Из полученных сравнительных данных, приведенных в табл,10, следует, что как флавоноиды, так и хлорофиллы значительно ухудшают точность и селективность способа-прототипа. В предлагаемом способе мешающее влияние этих примесей практически полностью компенсируется, Следовательно, предлагаемый способ более селективен и позволяет получить большую точность анализа.П р и м е р 12 (сравнительное испытание прототипа и предлагаемого способа), Навески 0,29-0,33 г лепестков хризантемы корейской "Бекон" анализируют на содержание суммы антоцианинов предлагаемым способом и способом-прототипом в трех повторностях. Параллельно проводят аналогичные аналитические определения в присутствии внутреннего стандарта - 1,15-1,26 мг пел-, ларгонидина.Сравнительным испытанием установлено, что предлагаемый способ имеет большие чувствительность, точность, лучший выход внутреннего стандарта. Резкое отличие между полученными результатами в предлагаемом способе и способе-прототипе объясняется низкими экстрагирующими свойствами системы растворителей прототипа. Результаты сравнительных испытаний приведены в табл,11,Формула изобретения Способ количественного определения суммы антоцианинов, предусматривающий их экстракцию из растительного материала в присутствии соляной кислоты и измерение значения оптической плотности полученного экстракта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности, экстракцию антоцианинов проводят двухфазной системой растворителей пентанол:концентрированная соляная кислота;вода в соотношении 10-12;10-12;2-4 в течение 10- 25 мин при 100-110 С, из полученного экстракта осуществляют отбор аликвоты органической фазы и обработку аликвоты в течение 20-25 мин смесью 30 фпероксида водорода и метанола, взятых в соотношении 1,5-2,0:2,5;2,0, причем смесь последних к1744647 10 пероксида водорода и метанола с последующим установлением величины разности измеренных значений, а количественное определение суммы антоцианинов осуществ ляют по установленной величине разности,аликвоте органической фазы берут в соотношении 1,5-4,0:1, измерение значения оптической плотности осуществляют на длинах волн 530 и 655 нм до и после обработки .аликвоты органической фазы смесью 30 оТаблица 1 Определение количества антоцианинов в плодах 1 е 9 цзтгцв чо 9 агеаблиц Определение антоцианинов в пищевом красит Объем органической фазы разбавлен до 2 0,248 0,247 0,248 0,251 0,247 0,241 0,241 0,243 0,246 0,247 1,555 1,590 1,580 1,600 1,595 2,100 2,105 2,085 2,120 2,105 0,120 0,120 0,100 0,105 0,100 0,200 0,195 0,205 0,190 0,185 0,175 0,175 0,175 0,180 0,180 0,270 0,270 0,270 0,275 0,270 0,005 0,015 0,005 0,001 0,001 0,040 0,040 0,055 0,035 0,040 2,91 3,00 3,01 3,04 3,04 3,86 3,88 3,84 3,93 3,901744647 12 Таблица 4 Определение антоцианинов в виноградном напитке Таблица 5 Зависимость выхода антоцианинов от длительности экстракции Таблица 6 Влияние температуры на экстракцию антоцианинов Таблица 7 Зависимость константы скорости окисления антоцианинов(х 10, с ) от количества перекиси водорода и природы спирта в окисляющей смеси1744647 14 Таблица 8 Зависимость констант скорости окисления антоцианинов(х 10, с ) от соотношения объемов аликвоты анализируемого раствора и окисляющей смесиТабл 9 Проце ица 10 а Влияние примесей на селективностьантоцианинов предлагаемым споспособом"прототипом очность аналиом и Завыаенирезультатов Спосо дяо ААвгрд 3 гГ Антоциан 2 4 О, 022 О, 020 00 00 0,132 0,136 0,181 0,172 0,175,17- для предлагаем 0,162 0,153 0,155 О, 151 О,57 0,172 0,170 0,178 пада антоцианинов при разном сос окисляющей смеси О, 012 0,011 0,011 00025 О, 021 О, 021 го способа, А:;-, " для прототипа( о м Ю а а- О 1 Ч:3 1 -.3 мм л в в о о о х Щ (Я л Б -1 (Ч в воо Ю о1- Юх ОщОоОО Охосло ос оо с со ц 0 МСО СО СО 0 в еь Еь о о о Ю а асо о о о е л еь 1- о Д с 1 9 О о о о с о ф 1 1 3 С 3 й 1 1 1 11 1 11 1 11 Э Д (" хл 0 оМ 1 3 Ю 111 СееГ;3. г 1 1 (;1 О. ЩЭС а х с 9 КЕ о Е Э 1 Щ л1- 2о:г 3 1 1 а 1 Ч:3а ма -о вл ммь еь СОСОО Ю л о о сЧ Л-е (Ч (Че (у 3 ммм (ч еьл л о о о о а во О ЩРедактор А,Маковская Те р д р Корректор З.Салко Заказ 2196 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям и 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 ТС Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 1