Способ количественного определения лигнино-целлюлозного комплекса в растениях

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 5 Ц 5 6 01 М 33/ САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ еллюлозного комп я оценки питатель кормов требуется еллюлозного комп ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) Авторское свидетельство СССР М 1411665, кл, 8 01 й 33/00, 1988,Журавлев Е.М. Руководство по зоотехническому анализу кормов, М.: Изд. сельскохозяйственной лит-ры, 1963, с. 86-88 (прототип).(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИГНИНО-ЦЕЛЛЮЛОЗНОГО КОМПЛЕКСА В РАСТЕНИЯХ Изобретение относится к аналитической химии природных соединений, в частности к способу определения лигнино-целлюлозного комплекса в растениях.Известен способ количественного определения лигнина в растениях, включающий экстракцию лигнина щелочным гидролизом, отделение зкстрагированного лигнина от негидролизованного остатка фильтрацией, подкисление фильтрата лигнина солянбй кислотой до образования осадка лигнина, выделение лигнина на хроматографической колонке, элюирование лигнина из колонки диметилсульфоксидом с последующим спектрофотометрическим определением.Недостатком известного способа является то, что он не позволяет проводить одновременное определение лигнина и" ЯО 1744648 А(57) Изобретение относится к аналитической химии природных соединений, в частности к способу определения лигнино-целлюлозного комплекса в растениях. Изобретение позволяет сократить время анализа при определении лигниноцеллюлозного комплекса в 7 раз по сравнению со всеми известными способами.Сокращение времени анализа достигается экстракцией лигнина из образца 1,5-2,0%- ным раствором МаОН при 155-165 С в течение 1,5-2 ч и определением целлюлозы по ее массе после отделения мешающих примесей неорганических и органических веществ последовательной промывкой негидролизованного остатка 3-5%-ным раствором НС и ацетоном до прекращения выделения окра- З шенных веществ. 3 табл, Ж цел л юл озы (л и гн и но-цеюйлекса) в растениях, а дл 4ности растительных Ьопределение лигнино-цлекса,1 ффИзвестен способ определения лигниноцеллюлозного комплекса, включающийобезжиривание образца, высушивание по- Офсле обезжиривания, гидролиз с 2%-ной соляной кислотой, отделение лигнина ицеллюлозы фильтрованием, высушивание,1остатка, гидролиз с 72%-ной серной кисло- атой, отделение и отмывку лигнина, высушивание лигнина, определение золы и азота влигнине для поправки к содержанию лигнина и определение целлюлозы по образовавшейся глюкозе.Недостатком способа является его длительность (48 ч или 7 рабочих дней),Цель изобретения - сокращение времени анализа при определении лигнино-целлюлозного комплекса в растениях.Поставленная цель достигается тем, что в способе количественного определения лигнино-целлюлозного комплекса в растениях, включающем гидролиз образца, отделение лигнина от целлюлозы фильтрацией и последующий анализ лигнина и целлюлозы, экстракцию лигнина из образца осуществляют 1,5-2 ф -ным раствором МаОН при 155- 165 С в течение 1,5-2 ч, а негидролизованный остаток после фильтрования последовательно промывают 3-5 ф - ным раствором НС и ацетоном до превращения выделения окрашенных веществ, полученный остаток высушивают и по его массе определяют в образце количество целлюлозы.Использование изобретения позволяет сократить время анализа при определении лигнино-целлюлозного комплекса в растениях в 7 раз по сравнению с известным способом.Сокращение времени анализа при определении лигнино-целлюлозного комплекса предлагаемым способом достигается за счет проведения щелочного гидролиза с последующим отделением растворенного лигнина от мешающих примесей на хроматографической колонке и его спектрофотометрическим определением, Одновременно при щелочном гидролизе. в раствор переходят мешающие определению целлюлозы жиры, белки, низкомолекулярныеуглеводы, пентазаны и основная часть окрашенных пигментов, а из негидролизованного остатка после несложной операции последовательной промывки его раствором НС и ацетоном получается чистая целлюлоза, количество которой определяется по ее массе, При этом исключаются имеющиеся в прототипе такие длительные и сложные операции как обезжиривание образца, многократный гидролиз кислотами разной концентрации, определения золы и азота для введения поправки к содержанию лигнина и определение целлюлозы по образовавшейся глюкозе с использованием реакций превращения окиси меди в закись восстановлением глюкозой, восстановления закисью меди железаи оттитровки полученного железаперманганатом калия.Способ количественного определения лигнино-целлюлозного комплекса в растениях является новым так как впервые для строго количественного определения лигнино-целлюлозного комплекса используют щелочной гидролиз с 1,5-2 ф -ным раствором чаОН при 155-165 С в течении 1,5-2 ч, а негидролизованный остаток после фильтрационного отделения последовательно промывают 3-5 -ным раствором НС и аце тоном до прекращения выделения окрашенных веществ. При этом отделяются адсорбированные на целлюлозе и мешающие ее определению труднорастворимые неорганические и органические соединения 10 и обеспечивается возможность определения целлюлозы.В изобретении щелочной гидролиз растений при определении лигнино-целлюлозного комплекса проводят с 1,5-2,0 -ным 15 раствором при 155-165 С в течение 1,5-2 ч.Использование концентрации гидроксида натрия, температуры гидролиза и времени гидролиза меньших, чем нижние границы установленных интервалов, приводит к не полному отделению целлюлозы от сопутствующих компонентов растений и получению завышенных результатов. Использование концентрации гидроксида натрия, температуры гидролиза и времени гидролиза боль ших, чем верхние границы указанныхинтервалов, приводит к частичному разрушению целлюлозы и получению заниженных результатов (табл,1).Полное выделение лигнина достигается 30 при щелочном гидролизе растений с 1-2 ным раствором МаОН при 150-165 С в течение 1-3 ч, Использование концентрации гидроксида натрия, времени гидролиза и температуры меньших, чем нижние границы 35 установленных интервалов, приводит к неполному выделению лигнина из растений.Использование концентраций гидроксида натрия, времени гидролиза и температуры гидролиза больших, чем верхние границы 40 указанных интервалов, приводит к снижению растворимости лигнина, что объясняется вторичной конденсацией гидролизованного лигнина.Выход лигнина и целлюлозы контроли ровали способом кислотного гидролиза ипредлагаемым способом, Аналогичные результаты получены при исследовании других растительных кормов - соломы и силоса,Исходя из оптимальных условий выде ления лигнина и целлюлозы из растенийследует, что проведение щелочного гидро- лиза растений с 1,5-2,0 ф -ным раствором МаОН при 155-165 С в течение 1,5-2,0 ч обеспечивает возможность одновременно го определения лигнина и целлюлозы в анализируемых растениях,Промывка негидролизованного остаткапосле фильтрационного отделения экстрагированного лигнина 3-5 -ным раствором НС необходима для отделения адсорбированных на целлюлозе труднорастворимых неорганических соединений гидроксидов, фосфатов, фитатов металлов и других соединений) после щелочного гидролиза, которые как установлено экспериментально, могут давать на 1-5% завышенное содержание целлюлозы. Использование для промывки соляной кислоты с меньшей концентрацией не обеспечивает быстрой отмывки трудно- растворимых неорганических соединений с поверхности целлюлозы, Использование 10 болеевысокой концентрации соляной кислоты не целесообразно, так как скорость отмывки адсорбированных труднораство 15 римых неорганических соединений остается без изменения, а расход соляной кислотыувеличивается.Промывка негидролизованного остаткапосле фильтрационного отделения экстра 20 гированного лигнина ацетоном необходима для отделения адсорбированных на целлюлозе водонерастворимых органических соединений, которые, как было установлено экспериментально, могут давать завышенное содержание целлюлозы на 5-10%, Использование ацетона обеспечивает быстрое отделение адсорбированных органических соединений и ускоряет последующее высушивание полученной целлюлозы. 25 Использование других, водонерастворимых органических растворителей (хлороформ, гексан, бензол и др,) не обеспечивает быстрого смачивания насыщенного водой негидролизованного остатка, в результате чего 30 продолжительность отмывки адсорбированных на целлюлозе, сопутствующих органических соединений увеличивается в 3-5. раз,Использование водорастворимых орга 35 нических растворителей (метанол, этанол) не обеспечивает быстрой отмывки адсорбированных органических соединений в связи с их худшей растворимостью в спиртах(продолжительность отмывки увеличивается в 2 40 50 вается время высушивания полученной целлюлозы,Пример конкретного определения лигнино-целлюлозного комплекса в растениях.Навеску растительного материала 0,250,5 г заливают 10-20 мл 1,7-1,8%-ного расраза по сравнению с отмывкой ацетоном). 45 Использование водорастворимых диметилсульфоксида, диоксана, диметилформамида нецелесообразно, так как эти растворители высококипящие, в результате чего увеличитвора ИаОН и выдерживают в течение 1,7- 1,8 ч при 160 С в герметически закрытой емкости. Полученный щелочной раствор лигнина отфильтровывают и используют фильтрат для отделения лигнина от мешающих примесей на хроматографической колонке с последующим спектрофотометрическим определением.Негидролизованный остаток на фильтре промывают 20-30 мл 3-5%-ного раствора НС 1 и 40-50 мл ацетона. Отмытый остаток высушивают при 105 С в течение 2,5 ч, взвешивают и по массе остатка определяют содержание целлюлозы.Результаты определения лигнино-целлюлозного комплекса в люцерновом сене, соломе и кукурузном силосе приведены в табл,З.В качестве добавки целлюлозы используется беззольная фильтровальная бумага, Аналогично определяют лигнино-целлюлозный комплекс в других растениях, При этом относительное стандартное отклонение не превышает 0,05,Таким образом, изобретение позволяет в 7 раз сократить продолжительность времени анализа при определении лигниноцеллюлозного комплекса в растениях по сравнению с известным способом, что дает возможность широко использовать предлагаемый способ в сельскохозяйственном производстве для оперативного контроля за содержанием лигнино-целлюлозного комплекса при организации рационального кормления сельскохозяйственных животных и заготовке кормов. Формула изобретения Способ количественного определения лигнино-целлюлозного комплекса в растениях, включающий гидролиз образца, экстрагирование, отделение лигнина от целлюлозы фильтрацией, последующий анализ, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью сокращения времени анализа, экстракцию лигнина из образца осуществляют 1,5-2%-ным раствором МаОН при 150-165 С в течение 1,5-2 ч, а негидролизованный остаток после фил ьтрационного отделения последовательно промывают 3-5%-ным раствором НС и ацетоном до прекращения выделения окрашенных веществ, полученный остаток высушивают, а определение целлюлозы в образце осуществляют по массе высушенного остатка.1744 Б 48 Таблица Время, ч Концентрация ИаОН,7 1,5 2,0 2,5 3,0 1,0 Т = 150 С 127,53 123,26 117,91 105,16 100,70 116,25 108,60 100,70 95,28 89,29 104,78 100,70 95,22 91,97 86,04 124,55 120,78 108,54 102,87 98,79 Т = 155 31,17 28,17 21, 16 10 96 04,40 1,0 1 ф 5 2,0 2,5 3,0 108,22100,0699,7496,5692,42160 С101,0299,9499,3690,5783,17- 165" С 102,04 97,64 95,03 91,27 38,91 108,41 100,51 99,68 97,71 92,73 129,38 121,16 114,85 109,88 100,70 7,77 3,82 6,30 2,85 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 101,34 100,25 99,36 94,90 88,91 128,68 118,99 113,77 97.77 94, 71 95,09 89,29 89,33 86,04 78,65 91, 01 89,23 86,04 79,03 71,38 2,0 2,5 125,68 112,94 101,98 92,03 91, 71 100,57100,0699,9490,8278,27 85,79 85,15 81,45 71,38 67,49 99, 9499,8799,9488, 1470, 11170 С 75,27 74,31 71,32 64, 12 1,0 1,5 2,0 2 5 3,0 83,62 78,39 65,65 58,76 55,13 76,55 70,81 62,08 56,91 51,11 110,3 97,13 94,90 85,21 70,36 92,42 89,2884,38 77,18 64,31 76,99 73,29 62,46 58,00 54,24 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Выход целлюлозы из люцерны (Ф от исходного содержания) в зависимостиот концентрации ИаОН, температуры и продолжительности гидролиза (п=5)10 1744648 Та бли ца 2 Выход лигнина ( от исходного содержания) в зависимости отконцентрации ИаОН, температуры и продолжительности гидролиза (и = 3) Время, ч КонцентрацияИаОН, 7 0,5 1,0 30 40 2,0 140 С 79 88 89 90 92 150 С 85 94 94 95 96 160 С 90 95 94 01 91 165" С 170" С 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 0,5 1,0 1,52,0 3,0 0,5 1,0 1 ф 5 2,0 3,0 0,51,01,52,03,0 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 96 96 95 95 94 94 95 96 95 95 84 92 94 95 95 88 09 99 99 97 93 9 Э 99 100 95 94 98 99 99 95 94 93 91, 93 85 96 94 97 96 Т = 92,Э 910010097Т = 9610010010092Т = 9510010010092Т = 91 92 93 91 88 86 93 95 95 94 92100100едактор И.Кас орректор З,С аз 2196 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Г на, 101 имечание. )мага,честве добавки целлюлозы используется беззольная фильтровальСоставитель Е,ИльинТехред М.Моргентал