Способ получения антибиотика и штамм -продуцент антибиотика ввм-1644

АЗ БРЕТ Я ПАТЕНТ 39144 культивие, содержащейазота, в глубс последующим айига зр. АТССитательной сред инныхотем целевог выдел ака го о тазы КАДУЦЕНТ щадила зр., А ре Сп 1 иге Со антибиотика В биотика, м Асдт а СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОИ ШТАММ АСТ 1 ЮМА 1 Н 1 ВА БР. - ПАНТИБИОТИКА ВВМ.(57) 1. Способ получения анзаключающийся в том, что шт ЯО 1241997 С 12 Р 1/06 // (С 2 Р 1/06С 12 К 1:03) точники углерода аэробных условия делением биомасс продукта из жид кой. 2. Штамм Асп39144 (Ашерсап Туоп) - продуцент1644.Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотика.Целью изобретения является разработка способа получения нового поли"пептидного антибиотика, обладающегопротивоопухолевой активностью,Целью изобретения также являетсяизыскание штамма, способного продуци.ровать этот антибиотик,Штамм АсТ 1 пошайцга зр. Н 710-49 выделен из почвенного образца, Депонирован в Американской коллекции типовых культур под номером АТСС 39144и характеризуется следующими признаками.Культурально-морфологические признаки.Штамм образует как субстратный,так и воздушный мицелий. Субстратныймицелий длинный и разветвленный ине фрагментируется на короткие цепочки нитиКороткие споровые цепочкизарождаются на верхушке или моноподиальном ответвлении воздушного мицелия. Споровые цепочки содержат2-15 спор на цепь (4-8 спор) и могут быть прямыми или иметь формукрючка или петли. Споры имеют бородавчатую поверхность и овальную илиэллиптическую Форму 0,5-0,6,Х О,в. 1,2 мкм) с круглым или эеостреииымконцом. Зрелые споры часто отделяются друг от друга полыми гифами.Иногда наблюдаются терминальные наплывы гифы на субстратном мицелии, помещенном на агар Чапека и агар Беннета,Триптон-дрожжевой экстракт-бульон.Рост хлопьевидноопущенный, седиментированный и не пигментированный.Агар ЧапекаРост скудный. Окраска от бесцветного до бледооранжевого (73) Цветной стандарт из книгиК.Л.Келли и Д,Б.Джудд, 1 БСС-ЮВС со 1 ог-паше сЬаггз 11 иэггасес 1 ч 1 гЬсепггодй со 1 огз, О,8. Веуг ог Сошш,с 1 ге 553, Вашингтон, ЭиС.у 1975 г.).Воздушный мицелий скудный, белый(263)р пигмент отсутствует.Глюкоэоаспарагиновый агар. Ростплохой. Окраска от желтовато-желтого (92) до темного оранжевого-желтоватого (69). Воздушный мицелий оченьскудный, белый (263), пигмент отсутствует,Глицерин-аспарагиновый агар. Ростот плохого до умеренного. Окраска отслабо-желтого (89) до темного оранжевато-желтого (72), Воздушный мицелийслабораэвитый, белый (263) до слабогожелтовато-розового (31). Пигментбриллиантово-желтый (83) .Крахмальный агар с минеральнымисолями. Рост от слабого до умеренно 10 го, Окраска от бесцветного до глубо-кого желтого (85). Воздушный мицелиймм.слаборазвитыйр от розовато-белогодо слабо-желтовато-розового (31),пигмент отсутствует.1,1 Тироэиновый агар. Рост умеренный.Окраска от коричневато-оранжевогодо умеренного красновато-корич-невого (43). Воздушный мицелий слабораэвитыйу от белого до светло-желтого.20 (89)е Пигмент сильный, желтый (84),Агар с дрожжевым экстрактом и экстрактом солода. Рост умеренный, Окраска от темно-желтого (88) до темнокоричйевого (59), воздушный мицелий2.у скудный белый (2631. пигмент свет-,лый,оливково-коричневый (94),Агар Беннета. Рост умеренный, окраска от серовато-желтовато-коричневого (180) до темного серовато-козо ричневого (62),воздушный мицелий оченьскудный, белый (263), пигмент умеренный оливково-коричневый (95) .Физиолого-биохимические признаки,Максимальный рост на агаре Беннета при 28 С, Умеренный рост при 203.1и 37 оС. Отсутствие роста при 10 и41 С Желатин разжижает. Крахмал гидролиэует. Снятое молоко пептонизируету не коагулирует. Меланоиды невырабатывает. Нитраты в нитриты восстанавливает.Умеренно устойчив к МаС 1 - ростпри концентрации 77, отсутствие роста при концентрации 103, Устойчив клиэоциму, рост при Оу 0017 Оптимум4)рН 6,0, при рН 5,0 рост отсутствует,Усваивает глицерин, (+) арабиноэу,б-ксилозу; 3-рибозу 1,-рамнозу,Ь-глюкозуу Ь-фруктозуу целлобиозу,трегалозу, растворимый крахмал,Э-маннитп.Не усваивает П(-)-арабинозуу Ь-га,лактозу, Ь-маннозу, 1.(-)-сорбозу,сахарозу, лактоэу, мелиоидозу, раффиноэу 0(+)-мелеэитозуу целлюлозу,5 л1241 3П р и м е р 1. Ферментация.Готовят посевную среду, содержащую,. Е: маннит 1, пентон 2 и дрожжевой экстракт 1; рН 7,2 (до стерилизации). 100 мл среды в 500 мл колбеЭрленмейера инокулируют культурой,инкубируют при 32 С в течение 72 чна роторной качалке (250 об/мин), Затем 5 мл культуры переносят во вторую посевную среду (100 мл) того жесостава и культивируют в тех же условиях.5 млпосевного материала вносятв 100 мл ферментационной среды, содержащей, 2; маннит 2,5; глюкоза 0,5; 15соевый порошок 1, пептон 0,5, мяснойэкстракт 1, СаСОз 0,3 и НаС 1 0,2,помещенной 500-мл колбу Эрленмейера.Ферментацию проводят при 28 Сов роторном смесителе при скоростивращения 250 об/мин.Антибиотическая активность достигает 300 мкг/мл через 6-7 дн.П р и м е р 2. Выделение,18 л культуральной жидкости, полученной по примеру 1, центрифугируют,полученную жидкую фазу концентриру-,ют при температуре ниже 40 оС до 1/10начального объема, Концентрат анализируют с помощью целлофановойтрубки против водопроводной воды в холодном помещении. Диализат концентрируютдо объема 1,5 л и центрифугируют(8000 я) для удаления нерастворимыхвеществ. Прозрачный верхний слой на 35сыщают сульфатом аммония и выдержиовают .в течение 5 ч при 5 С, Полученный осадок отделяют центрифугированием, растворяют его ь300 мл воды и обессоливают путем40диализа против водопроводной воды.700 мл диализата содержит 22 г неочищенного твердого антибиотика. Раствор антибиотика пропускают через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой С , 400 мл,45колонку промывают 1 л воды и проявляют 1/15 М фосфатным буфером рН 7,0,содержащим 0,3 М ИаС 1. Активные фракции объединяют (300 мл), диализуютв течение 18 ч против водопроводной50воды и хроматографируют на колонкес ДЕАЕ в целлюлоз (400 мл), которуюуравновешивают 1/14 М раствором фосфатного буфера рН 7,5, Эту колонкупроявляют тем же буфером, содержащим55градиентную концентрацию МаС 1 (О 0,2 М). Активный элюат (17 мл) обессоливают путем диализа и загружают вколонку с ДЕАЕ-сефадексом А. 997Колонку проявляют 1/15 М раствора буфера фосфатного, рН 7,5, содержащимградиентную концентрацию ИаС 1 (О -0,3 М). Активные фракции объединяюти диализуют против воды в течение18 ч. Обессоленный раствор (18 мл),хроматографируют на колонке с ДЕАЕсефадексом А 50 с использованием1/15 М раствора фосфатного буферарН 7,0 с содержанием ИаС 1 от 0 до0,3 М в качестве элюента.Соответствующие фракции собирают,концентрируют до объема 10 мл и обессоливают на колонке с сефадексомС. Колонку элюируют деионизированной водой и активный элюат лиофилизируют. Получают 120 мг белого аморфного порошка.При исследовании методом бумажного электрофореза высокого напряжения (4500 В, в 0,05 М барбиталовомбуфере при рН 8,6) антибиотикВВМмигрирует в виде кислоты,передвигающейся на 8,7 см через 1 чв направлении анода,Антибиотик не имеет определеннойточки плавления и постепенно разлага-ется при температуре выше 240 С. Растворим в воде, практически нерастворимв обычных органических растворителях.ЕбОптическое. вращение: с (а) По= -75,6 в 0,257-ном водном растворе.УФ-спектр имеет арсорбционный максимум при 275 нм (Е8,2) и 310 нм(Есм 4,6, плечо) в водном раство 4 Уре. В 0,01растворе НС 1 УФ-спектрпрактически идентичен УФ-спектру вводе, в 0,01 1 растворе ИаОН имеетлишь один максимум при 285 нм (Е48,9). ИК-спектр, снятый в КВг, указывает на наличие ИН-и ОН-групп (3302880 см ) и амидных групп (1650 и1540 см 1)Дает положительные реакции на реагент Фолин-Лоури, ксантопротеин, биурет и нингидрин, обесцвечивает раствор перманганата калия.Дает отрицательные реакции с антроном и реактивом Сакагуши.Молекулярный вес примерно 22000,Элементный состав, Е: С 46,6; Н6,45; Н 13,43; Я 0,2.Имеется 13 видов аминокислот: аланин, аспарагиновая кислота, глицин, полу-цистеин, глутаминовая кислота, изолейцин, лейцин, фенилаланин, пролин серин, треонин, тирозин, валин. Антибиотик довольно устойчив в интервале значений рН от 2 до 9. Вод"Антибиотик. может применяться вкомбинации с инертными носителямив любой фармацевтической форме, упо-, 5 требляемой для парентерального применения. Составитель Г.СмирноваТехред И.Попович Корректор Х,Колб Редактор Ю.Середа Заказ Зб 19/60 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4 3 1241997 б ный раствор устойчив в течение 2 ч ные дозировки антибиотика вводят мы - при 50 фС при нейтральном значении, шам внутрибрюшинно через 24 ч пос- рН, После экспонирования на УФ све- ле имплантации опухоли. Применение те антибиотическая активность теря- препарата осуществляют 1 раэ в день ется эа 20 мин. 5 на 1, 4 и 7 сут тройная доза черезСпособен индуцировать профаг в день или последовательно в течение лизогенных бактериях. 9 дн 1 доза ежедневно . НаибольшейПроявляет антимикробную актив- активностью против лейкемии мышей ность по отношению к грамположи- обладает препарат в дозе 0,03- тельным и кислотоустойчивым бакте О 1,0 мг/кг/день. риям.Противоопухолевую активностьпроверяют на мышах линии ВЩ противлимфоцитной лейкемии Р 388. Каждомуживотному инокулируют внутрибрюшинно 310 клеток опухоли. Определен -