Способ получения пептидов или их солей

.ЯО 138061 АЗ Ювъ ФФЮ Р Г ф 1 г фф ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ПАТЕНТ В 9о Эрба С.п.А.(1 Т)Т, ЭЕ), ДжузеппеКастильоне (1 Т)8.8)е К, Пептиды. М.:16ании Я 2130590 А,публик. 1984,ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТ ОВ ИЛИ оре ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) Шредер Э ЛюбМир, 1967, ч.1, с,Патент Великобрикл. С 07 С 103/52,(54) СПОСОБ ИДИХ СОЛЕЙ(57) Изобретение относится к пептидам в частности к получению пептидов ф мулы (1): Х-А-В-Тгр-С- НС 1, гд Х - водород или трет-бутоксикарбонильная группа, А,еи или АЬх, В-РгО или С 1 у, С-Ча 1, 1,еи, Мес или РЬе, или А, В и С независимо друг от друга представляют химическую связь при условии, что по крайней мере один из 51)4 С 07 К 7/06 // А 61 К них является аминокислотным остатком,У - метокси или аминогруппа, и равно1, когда Х - водород, и и равно О,когда Х трет-бутоксикарбонильная группа, или их солей, обладающих способностью стимулировать рост животных,и могут найти применение в ветеринарии. Цель - получение новых более активных веществ указанного класса.Получение соединений (1) ведут конденсацией соединения формулы (11): Х-А -В-ОН с соединением формулы (111)Н-Тгр-С-У, где А, В, С и У - указанывыше, Х -трет-бутоксикарбонильнаягруппа, в присутствии дициклогексилкарбодиимида отдельно или вместе сагентом, предотвращающим рацемизацию,или смешанного ангидрида, активированного производного сложного эфира,или азида соединения формулы ( 111),Целевой продукт выделяют после отщепления в случае необходимости защитных групп, Испытания показывают, чтосоединения (1) малотоксичны и значительно увеличивают скорость синтезапротеинов тканью печени, 6 табл, 13806 1511 зобретение относится к способуполучения новых биологически активных соединений - пептидов или ихсолей, обладающих способностью стимулировать рост животных, которые могут5найти применение в ветеринарии.Цель изобретения - новые пептиды,обладающие низкой токсичностью и более высокой способностью стимулировать рост животных,Значения К определяют на пластинах, Предварительно покрытых слоемсиликагеля 60 Р(Мерк), толщиной0,25 мм, длиной 20 см с использованием следующих проявляющих систем;Система Л, Бензол:бензин (60:ЬО)(этилацетат = 70:10:40 по объему;Система В, Бензол:триацетат:уксусная кислота;вода = 100;100;20:10 пообъему (верхняя фаза);Система С. Бензол:этилацетат:уксусная кислота:вода = 100:100:40:15по объему (верхняя фаза);Система О, н-Бутанол:уксусная кислота:вода = 4;1:1 по объему;Система Е, Метиленхлорид:метиловый спирт = 98:2 по объему;Система Р, Метиленхлорид;метиловый спирт = 95:5 по объему ("Е,Мерк" 30является торговым названием).Лнализ с помощью тонкослойнойхроматографии проводится при температуре н интервале от 18 до 25 С; поэтому .начения К изменяются на +57.Температуры плавления определяют воткрытых капиллярах с помощью аппарата системы Тоттоли и они не были откорректированы, Большинство производных размягчаются и разлагаются до дос тижения температуры плавления, Высоковольтный электрофорез на бумагепроводят в аппарате системы ферографориджинал-Франкфурт типа 64 на бумаге фирмы Шлейхер и Шюл У 2317 при5показателе рН 1,2 (муравьиная кислота:уксусная кислота;вода = 123:100:777) и напряжения 1600 в (40 В/см)и при показателе рН 5,8 (пиридин:уксусная кислота:вода = 450:50:4500)и напряжении 1400 В (32,5 В/см). Этипродукты характеризуются подвижностьюотносительно С 1 п при показателе рН 1,2(Е, ) и при показателе рН 5,Ь (Е),Б изобретении используют символыи сокрашения, обычно применяемые вхимии пептидов, Другими используемыми символами и сокращениями являются:ЛсОЕг. - этилапетат; И 1 Р - диметилформамид; Ег О - простой диэтиловыйэфир; МеОН - метиловый спирт; Г 1 ММ-Г 1 -метилморфолин; РЕ - петролейный эфир;РЬе(С 1) - пара-хлор-Ь-фенилаланин;Р 1 р, - пипеколиновая кислота; 1 РгО -простой диизопропиловый эфир; 1 РгОН -изопропиловый спирт; ТНР - тетрагидрофуран,П р и м е р 1. Получение НС 1 кН,ец-С 1 у-Тгр-ОГ 1 е (17),Стадия 1, Вос.еп-С 1 у-ОЪг 1 (1).К раствору 4,63 г (20 ммоль) Вос 1,еи-ОН в 60 мл безводного татрагидрофурана последовательно добавляют2,2 мл (20 ммоль) Г 1-метилморфолинаи 1,98 мл (20 ммоль) этилхлорформатапри -12 фС.После перемешивания при этой температуре в течение 2 мин добавляютхолодный раствор (-30 С) 6,75 г(20 ммоль) тозилата Н-С 1 у-ОВг 1 и2,2 мл Г 1-метилморфолина (20 ммоль)в 60 мл диметилформамида,Реакционную смесь перемешивают втечение 45 мин при -12 С и в течение90 мин при 0-15 С, затем отфильтровывают от солей и упаривают в условияхвакуума. Остаток растворяют в этилацетате и несколько раз промывают насыщенными растворами хлористоГо натрия,содержащими 1 И раствор лимонной кислоты, 1 И раствором бикарбоната натрия и воду, Органический слой высушивают над безводным сульфатом натрияи растворитель удаляют в условиях вакуума.Было получено 6,81 г (выход 903)соединения (1) в виде масла. К, 0,59. Стадия 2, Вос.ео-С 1 у-ОН (11),6,6 г (17,44 ммоль) Вос.ец-С 1 у-ОВг 1 (1), растворенного в 50 мл метанола, гидрируют при комнатной температуре и атмосферном давлении вприсутствии 1,65 г 107-ного палладированного угля, Катализатор удаляютфильтрованием и раствор концентрируют в условиях вакуума.4,17 г (выход 837.) соединения (11)получают из смеси этилацетата и петролейного эфира, температура плавления 115-121 С, с 3 = 29,0 (с = 1,МеОН); К= 0,50; Е , = 0,75,Стадия 3; Вос.ец-С 1 у-Тгр-ОМе(111).Используя в качестве исходных материалов 3,95 г (13,70 ммоль) Вос 1.еи-С 1 у-ОН (11) и 3,49 г (13,70 ммоль)1380615 45,93 г (выход 852) соединения (Ч 11)в виде масла: К= 0,81.Стадия 4. НС 1 Н-АЬх-С 1 у-Тгр-ОМея (ЧЕ 11),Используя в качестве исходного материала 5,60 г (11,46 ммоль) Вос-АЬх-С 1 у-Тгр-ОМе (Ч 11) и действуя так,как описано в примере 1 (стадия 4),но применяя на стадии очистки метиленхлорид, содержащий возрастающее количество метилового спирта,(до 57,),в качестве элюента, из смеси этилацео- тата (простого диэтилового эфира получают 3,61 г (657 выход) соединения(Ч 111): температура плавления 114117 С (пена); Гс(7 р = +25,8 (с = 1,МеОН); К 1 = 0,64; Е 1 т = 0,79П р и м е р 3. Получение НС 1 хН-ЛЬх-С 1 у-Тгр-Мег-ОМе (Х),и Стадия 1, Вос-АЬх-С 1 у-Тгр-Мег-ОМею (Х),Используя в качестве исходных мая териалов 1,66 г (5,41 ммоль) Вос-АЬх 5 -С 1 у - ОН (Ч 1, пример 2) и 2,09 г(5,41 ммоль) НС 1 Н-Тгр-Мег-ОМе и действуя так, как описано в примере 1г (стадия 1), но применяя метиленхлоридна стадии очистки, из смеси этилацетата и простого диэтилового эфира получают 2,85 г (выход 877.), соединения(1 Х) К = 0 74Стадия 2. НС 1Н - АЬх - С 1 у-Тгр в Мес-ОМе (Х),Используя в качестве исходного ма 35териала 2,60 г (4 р 19 ммоль) соединения (1 Х) и действуя так, как описанов примере 1 (стадия. 4), но применяяна стадии очистки в качестве элюентаэтилацетат, содержащий возрастающеет количество метилового спирта (от10 до 157), из смеси изопропиловогоспирта и простого диэтилового эфираполучают 1,40 г (выход 607) соединения (Х), температура плавления 66-70 С(выход 907) частично очищенного соединения (111) в виде пены, использудля его получения простой диэтиловынэфир (К = 0,39; К = 0,69), послечего это соединение применяют в следующей стадии,Стадия 4, НС 1 Н.еи-С 1 у-Тгр-ОМе(1 Ч)5,75 г (11,77 ммоль) Вос,ец-С 1 уТгр-ОМе (111) растворяют в 60 мл насыщенного раствора хлористого водорда в ледяной уксусной кислоте, послечего в этот раствор добавляют 6 мланизола и 3 мл 2-меркаптоэтанола,Через 30 мин нахождения этого раствора при комнатной температуре завершается удаление элемента Вос, а растворитель удаляют в условиях вакуума пр30 С Сырой продукт очищают с помощьхроматографии на колонках из силикагеля (Мерк) 0,040-0,063 мм, использув качестве .элюента смесь этилацетатаи метанола 9:1.Из смесь этилацетата и простогодиэтипового эфира было получено 3,05= 0,67; Е= 0,80,П р и м е р 2. Получение НС 1Н-АЬх-С 1 у-Тгр-ОМе (Ч 111).Стадия 1, Вос-АЬх-С 1 у-ОВг 1 (Ч),Используя в качестве исходных материалов 4,63 г (20 ммоль) Вос-АЬх-Ои. 6,75 г (20 ммоль) тозилата Н-С 1 у-ОВг 1 и действуя так, как описано впримере 1 (стадия 1), из смеси этилацетата и петролейного эфира получаю6,66 г (выход 887.) соединения (Ч);температура плавления 84-86 С; (Ы 7 в-22,0(с = 1, МеОН); К у = 0,58.Стадия 2, Вос-АЬх-С 1 у-ОН (Ч 1).Используя в качестве исходного материала 6,35 г (16,78 ммоль) Вос-АЬх(Ч 111).Используя в качестве исходных материалов 4,12 г (14,28 ммоль) Вос-АЬх 55-С 1 у-ОН (Ч 1) и 3,64 г (14,28 ммоль)НС 1 Н-Тгр-ОМе и действуя так, как описано в примере 1 (стадия 1), получают Стадия 1Вос-Тгр-РЬе-ОМе (Х 1.), Используя в качестве исходных материалов 6,09 г (20 ммоль) Вос-Тгр-ОН и 4,31 г (20 ммоль) НС 1 Н-РЬе-ОМе и действуя так, как описано в примере 1 (стадия 1), из смеси этилацетата и простого диизопропилового эфира получают 7,73 (выход 837.) соединения (Х 1) температура плавления 117-120 С;Ыр= 20,2 (с = 1, МеОН); К . = 0,79;0,56Стадия 2, НС 1 Н-Тгр-РЬе-ОМе (Х 11),Используя в качестве исходного ма 5териала 7,47 г (16,05 ммоль) соединения (Х 1) и действуя так, как описано в примере 1 (стадия 2), из смесиэтилацетата и простого диэтиловогоэфира получают 5,55 г (выход.867)соединения (Х 11): К 1 = 075,- 0,83,РСтадия 3, Вос-АЬх-С 1 у-Тгр-РЬе-ОМе(Х 111).Используя в качестве исходных материалов 1,83 г (6,35 ммоль) Вос-АЬх-Г 1 у-ОН (Ч 1) и 2,55 г (6,35 ммоль)НС 1 Н-ТКр-Рйе-ОМе (Х 11) и действуятак, как описано в примере 3 (стадия1), получают 3,19 г (выход 797) соединения (Х 111) в виде масла; К 10,76.сСтадия 4. НС 1 .Н-Айх-С 1 у-Тгр-РЬе-ОМе (Х 1 Ч).11 спользуя в качестве исходного материала 2,85 г (4,48 ммоль) Вос-АЬхС 1 у-Тгр-РЬе-ОГ 1 е (Х 111) и действуятак, как описано в примере 1 (стадия4), но очищая сырое маслянистое деблокиронанное соединение (Х 1 Ч) путемнескольких промывок простым диэтиловым эфиром, в конечном счете из смеси изопропилового спирта и простогодиэтилового эфира выделяют соединение(ХЧ).Используя в качестве исходных материалов 1,75 г (6,10 ммоль) Вос.ец-С 1 у - ОН (11) и 2,45 г (6,10 ммоль)НС 1 Н-Тгр-РЬе-ОМе (Х 11) и действуятак, как описано в примере 3 (стадия1) получают 3,10 г (выход 807.) сое 45динения (ХЧ) в ниде масла: К= 0,73.Стадия 2, НС 1.Н-Ьец-С 1 у-Тгр-РЬес-ОМе (ХЧ 1),Используя в качестве исходного материала 2,75 г (4,30 ммоль) Вос,ец-С 1 у-ТгрЪе-ОМе (ХЧ) и действуя так,как описано в примере 1 (стадия 7),из смеси изопропилового спирта и простого диэтилового эфира получают2,09 г (выход 857.) соединения (ХЧ 1): 55температура плавления 103-108 С (пена); ГЫ 3= 9,4 (с = 1, МеОН); К 1т 0 67П р и м е р 6. Вос-Тгр,ец-Г 1 Н ,Действуя так, как описано в предыдущих примерах, получают указанный взаголовке пептид с 807.-ным выходом.К 1 = 0,79, температура плавления158 С (изопропиловый спирт - простойдиизопропиловый эфир), о 3 = -18,4(с = 1, МеОН).П р и м е р 7. НС 1 Н-Тгр.ец-Г 1 НИспользуя в качестве исходного материала Вос-Тгр.ец-Г 1 Нполученный впредыдущем примере, и действуя так,как описано в примере 1 (стадия 4)получают указанное в заголовке соединение с 947-ным выходом, температурааплавления 135 С (этилацетат и простойдиизопропиловый эфир),Ы 3 п= +9,6(с = 1, ГеОН), К = 0,76; Е, = 0,84,пП р и м е р 8, НС 1 Н-Тгр-Ча 1-0 Ме,Стадия 1, Вос-Тгр-Ча 1-0 Ме,К раствору 12, 17 г (40 ммоль)Вос-Тгр-ОН в 100 мл безводного тетрагидрофурана последовательно добавляют4,5 мл (40 ммоль) Г 1-метилморфолина и3,96 г (40 ммоль) этилхлорформиатапри температуре -12 С, После перемешивания в течение 2 мин к реакционнойсмеси добавляют холодный раствор6,70 г (40 ммоль) НС 1 Н-Ча 1-ОМе и4,5 мл Г 1-метилморфолина (40 ммоль)в 50 мл диметилформамида. Реакционнуюсмесь перемешивают в течение 1 ч при- 12 С и 2 ч при температуре 0-15 С,отфильтровывают соли и выпаривают вусловиях вакуума, Остаток растворяютв этилацетате и последовательно несколько раз. промывают насыщенными растворами хлористого натрия, содержащими 1 М раствор лимонной кислоты,1 М раствор бикарбоната натрия и воду, Органический слой высушивают надбезводным сульфатом натрия, а растворитель удаляют в условиях вакуума.Изсмеси изопропилового спирта и простого диизопропилового эфира получают12,1 г (выход 84,47) указанного в заголовке соединения. К = 0 81 КфУ Э0,87,А 6Стадия 2, НС 1 Н-Тгр-Ча 1-0 Ме,12,52 г (30 ммоль) Вос-Тгр-Ча 1-ОМерастворяют в 15 мл муравьиной кислотыпри комнатной температуре,После завершения удаления элементаВос (контролируемого с помощью тонкослойной хроматографии) растворительоупаривают в условиях вакуума при 30 СОстаток растворяют в метаноле, охлажоденном до 0 С, после чего к этому ра10 створу добавляют 11 мл (33 ммоль) 3 Мраствора хлористого водорода в безводном тетрагидрофуране, Растворительудаляют в условиях вакуума, в результате чего из смеси иэопропилового5спирта и простого диизопропиловогоэфира получают 9,55 г (выход 907)указанного в заголовке соединения,Кр = 0,69; Е, = 0,98 С 1 ц,П р и м е р 9,НС 1 Н-Рго-ТгрМег-ИН.Стадия 1. Вос-Рго-Тгр-Мег-НН,ДИспользуя в качестве исходных материалов 1,722 г (8 ммоль) Вос-Рго-ОН 15и 2,967 г (8 ммоль) НС 1 Н-Тгр-Мег-ИНи действуя так, как описано в стадии1 примера 8, из иэопропилового спирта получают 3,828 г (выход 907) указанного в заголовке соединения:Ы)в =- -70,2 (с = 1, МеОН); К= 0,38;Стадия 2, НС 1 Ь-Рго-Тгр-Мег-ИН ,3,722 г (7 ммоль) Вос-Рго-Тгр-Мег-МНрастворяют в 40 мл муравьинойкислоты при комнатной температуре,После завершения удаления элементаВос (контролируемого с помощью тонкослойной хроматографии) растворитель упаривают в условиях вакууме прио3030 С. Остаток растворяют в метаноле,охлажденном до 0 С, после чего к этому раствору добавляют 3,6 мл(10,8 ммоль) ЗМ раствор хлористоговодорода в безводном тетрагидрофуране, Растворители удаляют в условияхвакуума, в результате чего из абсолютного этилового спирта получают2621 г (выход 807) указанного в заголовке соединения; Ы Я= -23,0 (с =МеОН) К О 41 ЕСП р и м е р 1 О, Н,ец-С 1 у-Тгрв-Мег-ЯН НС 1.Действуя так, как описано в предыдущих примерах, получают укаэанноев заголовке соединение с 797-ным выходом: температура плавления 180200 С (изопропиловый спирт - простойдиизопропиловый эфирЫ 3= +1,0(с = 1, МеОН), К= 0,63; Е = 0,66С 1 ц,Проведены биологические испытанияпептидов, полученных в условиях предлагаемого способа.Испытание на синтез белка в живоморганизме и в лабораторных условиях 55проводится в течение 7 дней с использованием группы из шести самцов крыс(Вистар, Хагеман, Экстерталь) раз Измерение скорости синтеза белкасоединений, перечисленных в табл, 1,существенно отличается от результатов, полученных в контрольной группе,состоящей из крыс, которым ежедневновводили физиологический раствор хлористого натрия ввиде подкожных инъекций,При определении стимулирующей ростактивности в живом организме крысамс исходным весом, примерно равным79 г, препарат вводят через рот вовремя кормления (стандартный рацион"Альтромин 1320") в дозах, составляющих от. 4 до 250 мг/кг веса тела, Еженедельно регистрируют привес и потребление корма. Результаты показаныв табл, 2 (дозы превращенных в сольпептидов относятся к свободным основаниям).Проведенные испытания показали,что пептиды, полученные в условияхпредлагаемого способа, малотоксичныи значительно увеличивают скоростьсинтеза протеинов тканью печени,Формула и э о б р е т е н и я Способ получения пептидов формулы (1) Х-А-В-игр-С-У НС 1 где Х водород или трет-бутоксикарбонильная группа;Еец или АЬх;Рго или С 1 у;Ча 1 1.ец, Мег или РЬе, или А В С деленных на подгруппы по три животных, которые содержатся в клетках из макролона, где в качестве подстилки применяется древесная стружка.Воду и пищу (стандартный рацион "Альтромин 1321", содержащий 197. сырого белка) дают животным по потребности.Пептиды вводят подкожно в виде раствора, ежедневные дозы которого составляют от 0,1 до 100 нг/кг.Измерение препарата производится в жидкостном сцинтилляционном счетчике Р 1. (1,0 мл + 5 мл сцинтилляционной жидкости) "ПРИАС".В табл. 1 приведены результаты измерений скорости синтеза протеинов тканью печени самцов крысы после обработки в течение 7 дней (ежедневные подкожные инъекции),)100 Низкая токсичность А,В и С независимо друг от другапредставляют химическую свяэьпри условии, что по крайнеймере один из них яВляетсяаминокислотным остатком;У - метокси- или аминогруппа;и1, когда Х - водород, и и = О,когда Х - трет-бутоксикарбонильная группа;или их солей, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что проводят конденсацию соединения формулы (11) Вос-Тгр - Ьец-ИН210 НС 1 Н-Тгр-Ьец-БН 2 10(соединение 1 Ч)100 с соединением формулы (111)Н-Тгр-С-У,где А,В,С и У - указаны,Х - трет-бутоксикароонильная группа,в присутствии дициклогексилкарбодиимида отдельно или вместе с агентом,предотвращающим рацемизацию, или смешанного ангидрида активированногопроизводного сложного эфира, илиаэида соединения формулы (111)и целевой продукт выделяют после отщепления в случае необходимости защитных групп.Таблица 1 3 7,группыполучившейпрепаратпо сравнению с контрольнойгруппойкрыс) 100 Низкая токсичность Сравнительное 12106 +17, 1100 10 50 Низкая токсичность 100 Таблица 2 Дозы, нг/кг веса тела (среднеезначение + стандартное отклонение) Показатели 6,0 30,0 60,1 Вос-Тгр,ец-МН 79,0+4,7 78,7+7,0 79,С+8,7 238, 5+10, 5 236, 5+11, 6 237, 3+11,6 Привес (абсолютный) 159,5 158,6 157,5+1,09 рольной группе НС 1 Н - АЬху(Руг-Рго-Тгр-Мег-ИН) Исходный вес Конечный вес Привес, ь по отношению к контрольной Оплата корма, г (абсолютное значение) Оплата корма, 7, поотношению к конт 606 +30,9 584 +26,1 547 +18,1+5,19 Таблица 4 Дозы, нг/кг веса тела (среднеезначение+ стандартное отклонение) Показ атели 61,9 123,8 2476 НС 1 Н-Тгр-Ча 1-ОИе 79,8+5,6 246,8+15,4167,0 78,5+6,1 79,8+4,7 236,4+17,7 236,2+12,8157,9 156,3 Привес, 7 по отношениюк контрольной группе+3,28 Исходный весКонечный весПривес (абсолютный) Привес, 7 по отношению к контрольнойгруппе Потребление корма,г Оплата корма, г(абсолютное значение) Оплата корма, 7. поотношению к контрольной группе Исходный весКонечный весПривес (абсолютный) Потребление корма, г16 15 1380615 Таблица 5 Дозы,нг/кг веса тела (среднеезначение + стандартное отклонение) Показ атели63,3 12616 31,6 НС 1 Еец-С 1 у-Тгр-МеТ-ХН Привес, 7 по отношениюк контрольной группе +7,76 Потребление корма, г 564,8 Оплата корма, г (абсолютное значение) 3,45 3,17 3,69 Оплата корма, 7 по отношению к контрольной-0,28 группе Таблица 6 Показатели Контрольная группа (среднее значение + стандартноеотклонение) Исходный вес 78,0+5,5 Конечный вес 230 ь 0+14 ю 3 Привес (абсолютный) 52,1 Потребление корма,г 556,9 Оплата корма, г (абсолютное значение) 3,66 Составитель В, ВолковаТехред Л, Олийнык Корректор Н. Король Редактор С, Полякова Заказ 994/59 Тираж 348ВН 1 П 1 ПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий1130.35, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная4 Исходный весКонечный весПривес (абсолютный) 79,9+4,4243,8+2 1,1163,9 78 эО+38255,7+6,5177,7