Способ получения гликопротеина, обладающего противоопухолевой и лектиноподобной активностью

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИН 291 4 С 12 Р 1/О И 10 ВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ГОСУД ДРСПО ДЕЛ(56) Патент США Ф 4051314,кл. 536-1, 1977.Патент СшА к,кл. 536-1, 1980,54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОРОТЕИНА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕОЙ И ЛЕКТИНОПОДОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ,аключающийся в том, что мицелий гриа рода Соко 1 ця экстрагируют водой или водным 0,01-2,0 н. раствором щелочи при,температуре 80-100 С в течение 1-8 ч, из полученного экстракта удаляют низкомолекулярные вещества путем диализа и/или ультрафильтрации, полученный концентрат подвергаютфракционному осаждению в изоэлектрической точке с рН 2,5 - 5 при ионнойсиле раствора от 0,1 до 3,1 д притемпературе 5-25 С в течение 1-8 ч,при поддержании рН на заданном уровне в процессе фракционирования выделяют фракции, содержащие целевойпродукт, нейтрализуют, обессоливаюти высушивают.2, Способ по п. 1, о т ющ и й с я тем, что экстракции подвергают мицелий гриба Сог 1 о 1 ця чегзсо 1 ог (Ег.) Цце 1, Сог 1 о 1 цз Мгзцгцз (Рг.) Яце 1, Сого 1 цз рагяешепцз1291027 4 О 45 50 55 Изобретение относится к медицинеи касается получения биологическиактивного соединения.Цель изобретения - создание способа получения нового гликопротеина;обладающего противоопухолевой и лектиноподобной активностью.Способ иллюстрируется следующимипримерами,П р и м е р 1. Штамм СМ Сого 1 цз чегвхсо 1 ог (Рг.) Яце 1 (РЕВМР 2412; АТСС 20547) культивируют в питательной среде, содержащей, вес.7:глюкоза 5; пентон 0,2 дрожжевойэкстракт 0,3; КН РО 0,1; МАЗО 7 Н О0,1, в течение 10 дней.Развившийся на поверхности культуральной среды мицелий гомогенизируютс водным Физиологическим раствороми получают посевную культуру.Ее высевают в каждый из 100 сосудов для культивирования емкостью1 л, содержащих по 200 мл среды вышеописанного состава и культивируютв течение 25 дней при 25-27 С. Получают 2,0-4,5 г/один сосуд проросшегомицелияе100 г полученного мицелия зкстрагируют 3 л водного О, 1 н,раствораИаОН при 9 С в течение,1 ч. Экстракт отделяют, нейтрализуют кислотой и концентрируют.Концентрат обессоливают и затемпоследовательно подвергают диализуи ультрафильтрации для удаления низкомолекулярных соединений, имеющихмолекулярный вес менее 5000,Концентрат (или порошкообразноесоединение, полученное высушиваниемобработанного концентрата) смешиваютс фосфатным буфером для поддержаниярН смеси 3,5 и после нейтрализациисупернатанта, полученного центрифугированием смеси, его подвергаютультрафильтрации для удаления солей,причем ультрафильтрацию проводят поддавлением 1,5 кг/см при 10 С с одновременным охлаждением и перемешиванием на аппаратуре для ультрафильтрации (настольный НгяИ 1 ою-,2000, Апп. -соп Сошпапу с диафрагмой ДМ), После концентрирования обессоленногосупернатанта в концентрат добавляютфосфатный буфер для поддержания рНсмеси 3, затем смесь центрифугируюти собирают осадок.Фракции, осаждающиеся при стабилизированном рН 3,5, ионной силе 0,30 п 2и температуре 5"С в течение 2 ч, отбрасывают, а собирают только Фрак,ии,осаждаемые из оставшегося растворапри рН 3,0 (изоэлектрической точкев интервале рН 3,0-3,5).Осадок растворяют в воде, доводятрН до ,0 и очищают обессоливанием,затем высушивают до порошкообразного состояния.Гликопротеин имеет следующие характеристики.Молекулярный вес 5000-300000. Весовое отношение белковой части к егосахаридной части от 50/50 до 80/20.И-концевая кислота представляет собой в основном тирозин, лейцин илиаланин,С-концевая аминокислотная последовательность представляет собой лейцинфенилаланин-валин,Элементный состав, 7,; углерод35,2-49,3; водород 4,8-8,0; азот4,3-12,3; сера от следов до 2,5;Фосфор от следова до 1,2; кислородостальное,Изоэлектрическая точка лежит в ин тервале РН 2 р 5-5,0,В качестве компонента в гликопротеин входит нуклеиновая кислота.По данным инфракрасной спектроскопии поглощения гликопротеин имеет максимум поглощения в интервалах 3600-3200 и 1200-1000 см , а также 35 при 1 б 00 и 1530 см ,П р и м е р 2-18. Вместо штаммаСМиспользуют каждый из штаммовгрибов, представленных в табл.Мицелий экстрагируют водным растворчтелем, таким как горячая вода иливодный 0,01-2,0 н, раствор щелочи при80-100 С в течение 1-8 ч. После удаления экстрагируемого остатка водныйэкстракт нейтрализуют кислотой и концентрируют, После обессоливания концентрат при необходимости подвергаютдиализу и/или ультрафильтрованию дляудаления низкомолекулярного соединения (м.в, менее 5000). Полученныйочищенный продукт при необходимостиконцентрируют и сушат до порошкообразного состояния. Затем прод,"кт подвергают, Фракционному осаждению в изоэлектрической точке с рН 2,5-5,0,ионной силе О, 1-3, 1 р и при те;ературе среды 5-25 С, в течечие более, чем0,5 ч,Характеристики полученных препаратов приведены в табл. 1,1291027 Физические и физиологические свойства предлагаемого сединения по примерам 1-18 приведены в табл. 2.Каждое из соединений по примерам 1-18 проявляет следующие характерные цветные реакции сахарида и белка;с -нафтол - сернокислотная .реакция - цвет темно-красный; индол - сернокислотная реакция - цвет коричневый; антрон - сернокислотная реакция - цвет 10 зеленовато-голубой; фенол - сернокисТа блица 1 Штамм БсгаЫ Номер депонирования Оеровдг 1 опХщпЬет о 2 тпе Ятгатп Вид культуры Брестев СМСМСМСМ(це 1 Согто 1 цв чегв 1 со 1 ог (Рг.)фле 1 Сог 1 о 1 цв чегвтсо 1 ог (Рг,) Оие 1 Сог 1 о 1 ив чегв 1 со 1 ог (Рг.)ф)е 1 Сог 1 о 1 цв чегв 1 со 1 ог (Рг,)Яие 1 Согто 1 цв чегв 1 со 1 ог (Рг.)Оце 1 Сог 1 о 1 ив чегв 1 со 1 от (Рг.)Яце 1 Сог 1 о 1 ив чегв 1 со 1 ог (Рг,)Цце 1 лотная реакция - цвет коричневый.;триптофан - сернокислотная реакция цвет красновато-коричневьщ; тиоглико левая кислота - сернокислотная реакция - зеленовато-коричневый; орсин/ солянокислотная реакция - зеленовато- коричневый; реакция Лоури-Фолина - цвет синий; нингидриновая реакция продукта гидролиза гликопротеина хлористоводородной кислоты - красновато- синий,РЕКМ-Р 24 12 (АТСС 2054 7) РЕКМ-Р 2413 (АТСС 20548) РЕКМ-Р 2414 (АТСС 20545) РЕКМ-Р 24 15 (АТСС 20549) ГЕВМ-Р 24 16 (АТСС 20550) РЕКМ-Р 24 17 (АТСС 20551) ГЕКМ-Р 2418 (АТСС 20552) РЕВМ-Р 2419 (АТСС 20553) ГЕКМ-Р 2420 (АТСС 20554) РЕКМ-Р 242 1 (АТСС 20555) РЕКМ-Р 2422 (АТСС 20556) РЕВМ-Р 2423 (АТСС 20557) РЕКИ-Р 2424 (АТСС 20558)иГ 6л 1д Оф Ц1 ии хО ХиОФ хО Хи суХ ГСхО ихх о О С 1 е ГЧОО СЧО СО а с и е- О=411 щ Оь СО ье щ сои оиОо сои СсСО о аьО и+ + хйфц 5л сц1О т,1 о Е Х х х хй 4 О О 0 й 1О :( О й С 1Э йа ое 3 ххв 3о Ей ох хх ой й цй оо д хай лххх ца й й1. Онйц 0хххао х хйй и ц1днлнцлхоцай охх О ц х Х о х Е сй о й а оХ ЮХхБ1и гО г а хо оЩ О Х ХО К Р аД ОО)к 1291027 х а х О а х К О О О сао Юкц ОВах хо э а О ъ дхюГЧ х ю. о 1 ф гг гг а а О О , оОХ ССхжО.ф х. и х С х х 1 Х1х хо О СС х фсО Ххх хс чОЦФ э с х