Урокиназа, иммобилизированная на фибриногене

СОЮЗ СОВЕТАХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИН гошЬоз,тромболтвом кующая сяО, 3850ржанием14, 12 Ма 1 сзхвеп 1 со,К.Магг,1 пес979, 568, 1ство СССР6, 1979. М ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ) 3590957/28-13(71) Всесоюзный кардиологичеснаучный центр АМН СССР(57) Урокиназа, иммобилизированнана фибриногене, общей формулы где Р - фибриноген,Е - урокиназа,п - О, 4, 7, 10, 12,обладающая пролонгированнойтической активностью и сродматериапу тромба, характеримол.мас. соответственно 360400000, 420000, 440000, содебелка соответственно 30, 1510 мас.й,Км 0Ксарй-оптимб 01 3 1128Изобретение относится к биоорганической химии, в частности к синтезубиологически активных соединений,обладающих сродством к материалутромба и проявляющих тромболитическую 5активность.Предлагаемые соединения представляют собой продукт связывания урокиназы с фибриногеном. Фермент уроки.наза широко используется в медицинедля лечениятромооэмболий кровеносныхсосудов. Фибриноген представляет собойбелок крови и после превращения вфибрин под действием тромбина является строительным материалом тромбов. 1Известны производные урокиназы,которые получают присоединениемфермента к различным носителям. Такполучают водонерастворимые производные урокиназы, например путем связывания ее с эритроцитарной массой 1.Однако для терапевтических целейпригодными являются водорастворимыепроизводные урокиназы, напримерэлектростатический комплекс фермента 5с гепарином 2 . К недостаткам подоб.ных производных относится их нестабильность.Наиболее близким к известным производным является препарат, представляющий собой урокиназу, ковалент.но связанную с декстраном 3 .Однако подобная модификация фермента не имеет сродства к материалутромба и поэтому повышение общейфибринолитической активности кровипри использовании таких производныхне гарантирует эффективного осуществления процесса тромболизиса.Цель изобретения - получение ново щго препарата - иммобилизованной урокиназы, обладающей пролонгированнойтромболитической активностью и сродством к материалу тромба.Цель изобретения достигается 4 эсвойствами иммобилиэованной урокиназы общей формулыг - с-хн-(снд - мн-с-к11О 0 ягде Р - Фибриноген,Е - урокиназа,и - О, 4, 7, 10, 12,характеризующейся мол.мас. соответственно 360000; 385000; 400000;420000; 440000 и содержанием белкасоответственно 30, 15, 14, 12,10 мас.7, получаемой присоединениеммолекул Фермента к фибриногенучерез алифатические днамины различной длины с предварительной активацией карбоксильных групп белков карбодиимидом.Способ осуществляют в три стадии,1, Активация карбоксильных группфибриногена с помощью карбодиимидаи присоединение к нему алифатического амина,Этот процесс проводят по общепринятой методике 41,К раствору фибриногена в дистиллированной воде (рН 3,8) добавляют100-кратный молярный избыток 1-этил(диметиламинопропил) карбомиида иинкубируют смесь 10 мин при комнатной температуре, после чего к нейопри рН 4,5 и температуре 4 добавляют 100-кратный молярный избытокалифатического амина в Фосфатномбуфере рН 8,3 и инкубацию продолжаютв течение 5 ч. Полученный продукт (1)диализуют против дистиллированнойеводы при 4, а затем против фосфатного буфера рН 8,3,2. Активация карбоксильных группурокиназы с помощью карбодиимида.К раствору урокиназы, предварительно отдиалиэованной против дистиглированной воды и Фосфатного буферарН 8,3, добавляют 1-этил(диметиламинопропил)карбодиимид молярномФ лотношении 1:100 и инкубируют при 4в течение 20 мин (продукт П) .3. Полученные урокиназы, иммобилиэованной на Фибриногене.Реакцию связывания урокиназыс Фибриногеном осуществляют сливанием продуктов 1 и 11 с последующейинкубацией смеси в течение 18 чпри 4 , Затем пролученный препаратоурокиназы, ковалентно связанной сфибриногеном,выделяют с помощью гельхроматографии илиультрафильтрации наприборе "Апп 1 соп" сфнльтром ХМ.Процесс получения производных урокиназы иллюстрируется следующей55 деляемой по гидролиэу метилового эфира ацетилглициллизина (Асье) . По кинетическим параметрам гидролиэа этого субстрата полученное производное близко к нативному ферменту, а но термостабильности превосходит его рН-оптимум каталитической активности модифицированной урокиназы по гидролизу.АСЬЕ сдвигается в кислую сторону по сравнению с нативным ферментом, переходя в область физиологических рН, Преимущество произ" водных заключается в повышении срод ства их к тромбу, что в результате обеспечивает большую эффективность тромболизиса.Кроме того, связывание фермента с высокополимерной матрицей, обычно повышает стабильность фермента в физиологических условиях, что означает удлинение сроков его действия и повышение эффективности ферментной терапии,При исследовании свойств предлагаемых соединений сравнение проводили с нативным ферментом, так как известное производное урокиназы проявляет свойства, идентичные свойствам нативного фермента.П р и м е р 1. 7,83 мг Фибриногена растворяют в 6 мл дистиллированной воды (3,810 М) при комнатной температуре, раствор подкисляют с помощью НС 1 до рН 3,8 и затем добавляют карбодиимида. Через 10 мин когда рН раствора достигнет максимального значения (рН 4,5), отбирают 2 мл раствора активированного фибриногена, который добавляют на холоду (4 С) к 2 мл раствора додекаметилендиамина (3,8 10 М) в 0,1 М фосфатном буфере рН 8,3 и инку бируют смесь в течение 5.ч. После этого инкубационную смесь диализуют в течение 2 ч на холоду сначала против дистиллированной воды, а затем в тех же условиях против 0,02 М фосфатного буфера рН 8,3 продукт 1 ). Препарат урокиназы (24.000 1 О)растворяют в 2 мл дистиллированнойводы и диалиэуют на холоду 2 чпротив дистиллированной воды, затемеще 2 ч против 0,05 М фосфатногобуфера рН 8,3. К отдиализованномураствору урокиназы добавляют 4 мгкарбодиимида и инкубируют смесь 5 1 О 15 20 25 30 35 49 45 Ф при перемешивании на холоду в течени20 мин (продукт Й ).После этого к раствору активиро-ванной урокинаэы (И) приливают 2 млраствора Фибриноген-додекаметилендиамина (1). Смесь инкубируют втечение 18 ч; при 4 С, затем полуоченный препарат выделяют из реакционной смеси с помощью ультрафильтрации на "Авсоп" с Фильтром ХМ.В результате эксперимента с фибриногеном связывается 80 Х урокинаэы,причем препарат сохраняет 50 Х эстеразной активности от первоначальной.Мол.мас. полученного продукта -440000, содержание белка - 10 мас, Х,П р и м е р 2. Процесс осуществляется так же, как и в примере 1,за исключением того, что в качествесшивающего реагента используется1, 10-декаметилендиамин,С фибриногеном связывается 90 Х урокиназы, сохраняемая препаратом остаточная зстераэная активность составляет 45 Х от первоначальной. Мол.мас,продукта - 420000, содержание белка - 12 мас.Х.П р и м е р .3, Процесс осуществляется так же, как и в примере 1,за исключением того, что в качествесшивающего агента используется1,7-гептаметилендиамин.С носителем связывается 85 Х урокинаэы, остаточная эстераэная активность производных урокиназа - Фиб"риноген 30 Х. Мол.мас. 400000, содержание белка 14 мас.Х,П р и м е р 4. Процесс осуществляется так же, как и в примере 1,за исключением того, что в качествесшивающего агента используется11, 4-тетраметилендиамин.К фибриногену присоединяется до90 Х урокинаэы. Препарат имеет остаточную эстеразную активность 40 Х.Мол.мас. 385000, содержание белка15 мас.Х.П р и м е р 5, Урокиназу присоединяют к фибриногену непосредственно,без удлиняющего мостика алифатического диамина.2 мл урокинаэы (12,000 1 О/ш 1) диализуют 2 ч при 4 С против дистиллированной воды, а затем против0,02 М Фосфатного буфера рН 8,3.К раствору урокиназы добавляют 2 млактивированного карбодиимидом фибриногена (3,810 М) и 1 мл 0,1 Мгеном без помощи диамиыа) характернымаксимальное значение Кц и минимальное значение К, что означает резкое снижение активности этого производного по сравнению с нативнойурокиназой,Присоединение урокиназы к фибриногену сдвигает рН-оптимум каталитической активности фермента погидролизу АС 1 Ме в кислую сторону,Так, рН-оптимум нативной урокиназы -8,3, рН-оптимум продукта модификацииурокиназы из примера 1 - 7,5. Этообъясняется элиминированием отрицательного заряда карбоксильныхгрупп в глобуле урокиназы при ихактивации карбодиимидом, Изменениеостаточной каталитической активностиурокиназы при ее модификации происходит следующим образом: активность фермента до модификации - 100 после стадии карбодиимидной активации - 88 , после связывания с фибриногеном, модифицированным1,12,додекаметилендиамином, - 57 ,после выделения полученного производного методом ультрафильтрации на11Апасоп - 5 2 Связывание Ферментас полимерной матрицей фибриноге нанаряду с т ем, что позволяет глоб улеФермента сохранять определенную подвижнос т ь ( изменения КК хат ) впридает получаемому препарату биокатализатора повьппенную стабильность, очем говорят данные табл. 2,Определение остаточной каталитической активности проводили нарН-стате по гидролизу 1 О М раствора АС 1 Ме в 0,1 М КС 1 при рН 7,5 икомнатной температуре.Экспериментальное определениетромболитической активности препаратов нативной и модифицированнойурокинаэы быпо выполнено согласноизвестной методике 5, с добавлением в омывающий раствор 0,33 мг/млплаэминогена человека. К 0,5 млраствора (10 мг/мл) фибриногенаприливают 0,2 мл раствора (4 мг/мл)тромбииа и выдерживают эту смесь 1 чпри комнатной температуре, за этовремя Формируется фибриновый остовтромба. Его помещают на проницаемуюпленку в закрепленную пластмассовую трубочку диаметром 1,0-1,5 см, днокоторой омывается 15 мл раствора О, 1 М Фосфатного буфера рН 7,4.В этом растворе растворяют плазуиио 7 1128601 8фосфатного буфера рН 8,3. Смесь инкубируют 18 ч при 4 С. Полученное прооизводное выделяют ультрафильтрацией.С фибриногеном связывается 90 урокиназы, препарат сохраняет до 32 первоначальной эстераэной активности,Мол.мас. 560000, содержание белка30 мас.Таким образом, присоединение урокиназы к фибриногену с .омощью раэ- Юличных алифатических диаминов спредварительной карбодиимидной активацией исходных белков позволяетполучать производные урокиназы, присоединенные к матрице носителя как 15через ножки различной длины, таки без них.Кинетические параметры каталитического гидролиэа такими препаратаминизкомолекулярного субстрата АС 1.Ме 20(рН 7,5; О, М НС 1, комнатная температура) незначительно отличаютсяот соответствующих констант нативнойурокиназы. Об этом свидетельствуютданные табл. 1. В качестве объекта 25сравнения использована нативнаяурокинеза, так как последняя в условиях эксперимента сопоставима сизвестным препаратом 3 .-2Концентрация АС 1.Ме 10 -1 О М, 30концентрация фермента в ячейке100 10/тп 1.Как видно из данных табл, 1,лучшие кинетические параметры средимодифицированных препаратов уроки 35назы имеет продукт примера 1 - урокиназа, присоединенная к Фибриногенус помощью 1, 12-додекаметилендиамина.Использование самой длинной из имеющегося набора ножек позволяет получать препараты, наиболее близкие посвойствам к нативному ферменту.По-видимому, длинная ножка в значительной степени устраняет неблагоприятное слияние на глобулу Ферментасо стороны матрицы, которое можетпроявляться в изменении конформационного состояния молекулы связанногофермента, в стерических затруднениях,возникающих при взаимодействии с усубстратом и т.д. Это подтверждаетсясравнением кинетических характеристик нативной урокиназы и продуктовее модификации. Так, по мере укорочения ножки для производных урокиназывозрастают величины К и уменьшаютсявеличины К , , Для продукта примера5 (урокиназа, связанная с Фибрино9 1128601 ген (0,33 мг/мл контроль), а такжепрепараты нативнойи модифицированной урокиназы, которые берут в соотношении, обеспечивающем их одинаковую эстеразную (АСЕМе) каталитическую активность 5 з Эа растворением фибринового сгустка Р следят по увеличению оптической плот- ( ности при Э = 280 нм омывающего раствора т по времени. Результаты эксперимента 3 приведены в табл. 3. 10 тОтношение прироста оптической б плотности раствора (в результатер деструкции при тромболизисе нерастворимого фибринового сгустка и Ф перехода его фрагментов в раствор) 1 з л к величине промежутка времени, за н который оно произошло, характеризует в скорость процесса тромболизиса (Сдк) т в такой системе. В контрольном экс-. в перименте значительного лиэиса фиб ф ринового сгустка не наблюдается. Э Для препаратов же нативной и моди- а фицированной урокиназы (продуктт примера 1) значения й 8 М составляют соответственно 0,3 и 0,5, что сви д детельствует о большой тромболитин ческой эффективности модифицирован- т ного производного и подтверждается Р также значениями времени полногорастворения тромба, составляющими 30 в 5 и 3 ч соответственно.Окончательные результаты экспери ментов по тромболизису представлены к в табл, 4; м 1 О 35Приведенные в табл. 4 данные показывают, что с ростом длины ножки использованного диамина растет эффективность тромболитического действия препарата модифицированной урокиназы.щ Можно предполагать, что причина этого заключается в наиболее благоприятном соотношении у таких производных подвижности фермента, удаленности его от матрицы носителя и ее способ Ю ности быть встроенной в материал тромба, Дальнейшее увеличение длины ножки нецелесообразно, так как утрачивается стабилизирующее влияние носителя и затрудняется его модифика . ция такими бифункциональными реагентами, возрастающая гидрофобность которых сокращает их реальную длину (скручивание метиленовой цепи). Как показывают опытные данные, 12 мети- И леновых групп в цепи реагента - это близкая к оптимальной длина межмолекулярной сшивки. Экспериментальное подтверждениевозросшей тропности препарата модиФицированной урокиназы к тромбу былопредемонстрировано следующим обраом: сформировавшиеся сгустки фибина омывались определенное время15 мин) растворами препаратов наивной и модифицированной урокиназы.атем сгустки переносили в растворыого же буфера без фермента и инкуации в течение 3 ч. В этих раствоах определяли прирост оптическойплотности, т.е. скорость растворенияибринового сгустка, причем контроем служил буфер, содержащий плазмиоген и омывающий фибриновый сгустоктечение всего времени эксперимена. Показано, что происходит быстроестраивание и Фибриновый сгустокибриногена из омывающего раствора.то включение обнаруживается визульно уже через 5-15 мин (см,абл. 5).Из данных табл. 5 следует, чтоействие нативного препарата урокиазы (8 Ф О,5) по эффективностиромболизиса близко к данным контольного эксперимента (р, к 0,14),Фибринолиз в контроле объясняется,ероятно, наличием в препаратеплазминогена примесей плазмина .начительно большую тромболитичесую активность обнаруживает продуктодификации урокиназы из примера1 (ЕдЫ 0,3). Это означает, чтоименно это производное урокиназыобладает сродством к Фибриновомусгустку, поскольку влючается внего при первой 15-минутной инкубации и переносится вместе со сгусткомв буферный раствор, где в течение3 ч продолжается фибринолитическоедействие препарата. Более того, приповторении этого эксперимента с темиже фибриновыми сгустками несколькораз (до 5, см. табл. 5) обнаруживается, что производные урокиназыобладают способностью дополнительновстраиваться в уже лизирующийсятромб, о чем свидетельствуют возрастакяцие значения (от 0,3 до 0,46) Тр 6характерного показателя эффективноститромболизиса. Как видно из табл. 5,подобная способность несвойственнанативной урокиназы,Синтез препаратов урокиназы,ковалентно связанных через алифатический диамин с Фибриногеном, позво11 112 ляет получить производные фермента, обладающие высокой тромболитнческой активностью, повышенной стабильностью и. сродством к материалу тромба. Подобные производные урокинаэы представляют собой эффективные средства системного тромболизиса нролонгиро- ванного действия, которые могут Выть использованы при инфарктах миоТаблица 1 Кинетические константы описываемых производньм урокинеэы 1 ЭПродукт примераТ Т 1 1 2 3 4 5 3,0 "10 11,0 10 13 10 14" 10 15,0 10 18,0 10 К сек са 30 33 29 27 21 Таблица 2 Стабильность производных урокиназы Сохраняемая препаратом остаточная каталитическая активность при инкубации при 50 С в О,1 М фосфатном буферерН 7,5 через, ч Препарат 1 48 3 7 14 24 Нативнаяурокиназа 56 1 О 38 80 Продукт примера 47 60 32 75 56 86 75 86 73 42 60 76 88 44 66 78 90 Кинетический пара- Нативная метр препарата урокинаэа 8601 2карда, эмболиях легочных артерий,тромбозах сосудов головного мозгаи ряде других заболеваний. Использование подобных препаратов урокиназыоблегчит курс лечения и повысит егоэффективность за счет снижениярасхода дорогостоящего фермента,удлинения срока,и обеспечения строгойнаправленности действия.13 14 1128601 Таблица 3Динамика растворения фибринового сгустка под воздействиемпроизводного урокиназы Нативная урокиназа Урокиназа,1,12-додекаметилендиаминфибриноген Время,мин А 28 Ага о А7,30 12 90 30 43 80 150 42 100 64 82 100 Таблица 4 Результаты тромболизиса1 Время полного растворения фибриновогосгустка, ч Скорость растворенияфибринового сгусткайдк,Препарат Нативная урокиназа Продукт примера 1 0,3 0,5 3 ч 45 мин 0,43 0,40 4 ч 20 мин 0,36 5,5 0,25 0,292 О, 0,326 0,034 0,383 0,091 1 СО 0,418 0,126 240 0,484 0,192 270 0,539 0,247 300 0,592 0,300 0,842 0,809 0,971 1,083 1,144 О, 037 0,129 0,241 0,3021128601 6 Таблица 5 Результаты экспериментов по исследованию сродства производных к тромбуПрепарат 15 15 0,14 О, 15 0,17 0,16 0,14 0,3 0,42 0,38 0,44 0,46 0,14 О, 14 0,14 О, 14. Контроль 0,14 0,22 0,26 0,28 0,30 0,31 0,19 0,22 0,24 0,25 0,27 0,26 0,16 0,20 0,23 0,25 0,11 0,12 0,12 0,14 0,15 Корректор В, Бутяга Редактор Л, Письман Заказ 4513/5 Тираж 525 Подписное Нативная урокиназа Продукт примера Скорость растворения фибринового сгустка за 3 ч в растворебуфера после инкубации с препаратом в течение (в мин) 1 СоставительТехред Т.Фанта ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Ьсква, Ж, Раущская наб д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г . Ужгород, ул. Проектная, 4