Способ получения антибиологического комплекса, обладающего противоопухолевой активностью

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Сафа Сфветскии Сецналистическик Республик(23) Гриоритет - (32) 0204,79 Государствеииий комитет СССР по Аедаи изобретеиий и отвритий(53) УДК 615. 779. ,931(088. 8) Дата опубликования описания 230283 ИностранцыХидео Косияма, Фумихиде Сакаи и 4 фаВи,Окумаг;РсИностранная фирмаБристоль Мейерз Компани(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА, ОБЛАДАЮШЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Изобретение относится к областимикробиологии и касается способа получения антибиотического комплекса,обладающего противоопухолевой активностью 5Известен микробиологический способ получения антибиотика хиномицина, относящегося в структурном отношении к хнноксалиновой группе антибиотиков1,10Целью изобретения является получение антибиотического комплекса,обладающего противоопухолевой активностью.Поставленная цель достигается 15тем, что согласно способу полученияантибиотического комплекса, обладаю.щего противоопухолевой активностью,отличием является то, что штаммАсй 1 пошадцга эр. С - 455 - 101 выращивают в жидкой питательной среде,содержащей источники углерода н азота в аэробных глубинных условиях споследукнцим выделением антнбиотического комплекса и/или разделением 25его на компоненты А, В, С, О, Е, Е.Штамм Асй 1 поаайцга 5 р. 6-455-101выделен иэ образца почвы, собраннойна Филлипинских островах, депонирован в Американской коллекции культур 30 микроорганизмов (АТСС) под номером АТСС 3 1491-и характеризуется следу" ющими признаками.Морфологические признаки.Штамм С-101 образует субстратный и воздушный мицелий. Субстратный мицелий хорошо развит, длинный и разветвленный (0,5-0,8 м вширину ). Отчетливая фрагментация субстратно-, го мицелия не видна. Воздушный мицелий короткий или рудиментарный, в некоторых агаровых средах не обра- зуется вообще. В воздушном мицелйи образуются короткие или длинные спороносные цепи, которые содержат 2-50 овальных спор в цени (главным образом 5-20 спор). Спороносные цени прямые, извилистые или петлеобраэные по виду. Споры сферические (0,3- 0,4 м), овальные или цилиндрические (0,3-1,5-3,0 м) по виду и имеют гладкую поверхность. Споры частот отделяются с помощью пустых гифов. Иногда на воздушном мицелии образу" ется аморфный спорангно-образный пузырек, из которого развивается короткая змееобразная спороносная цепь.Клеточная стенка штамма С-.455-101 содержит меэодиамииЬпимелнновую ки999981слоту, но не содержит глицин. При гидролиэе целой клетки обнаружено присутствие глюкозы, маннозы и маду ,розы (З-О-метил-Р-галактозы).Культуральиые и физиологические свойства.Штамм С-101 растет обильно, образует розовый или серовато-розовый воздушный мицелий и дает красноватый не растворимый в воде пигмент на богатой питательными веществами агаровой среде, такой как агарс ,дрожжевым экстрактом и солодбвым экстрактом и агар с овсяной мукой. Однако на средах, таких как неорганические соли - крахмальный агар, глицерин-аспарагиновый агар и тирозиновый агар в .штамм дает плохой рост, образует белый или бежевый. рудиментарный воздушный мицелий и дает небольшое количество красноватого пигмента. Меланоидный пигмент не продуцируется напептондрожжевомжелезном агаре и тирозиновом агаре. Растет обильно при 28 С, 27 С и 45 С, но не растет при 10 С или 50 С.Агар Чапека. Рост ограниченный или отсутствует. Субстратный мицелий (обратная сторона) темно-розовый. Воздушный мицелий белый до бледнорозового.Растворимый пигмент отсутствует.Бульон триптон-дрожжевой экстракт; Рост умеренный, хлопковидно-опущенный, седиментированный и непигмен,тированный.Агар с дрожжевым и солодовым экстрактом. Рост обильный. Субстратный мицелий (обратная сторона) темно-красный до красновато-коричневогО Воздушный мицелий обильный;серовато-розовый до пурпурно-розового, растворимый пигмент отсутствует.Овсяный агар. Рост обильный. Обратная сторона субстратного мицелия интенсивно желтовато-красная. Воздушный мицелий умеренный, розовый, растворимый пигмент оеровато-желтый.Неорганические соли - крахмальный агар. Рост плохой. Обратная сторона субстратного мицелия слегка желтоватокоричневая до темно-красного. Воздушный мицелий ограниченный, белый,до бежевого, растворимый пигмент отсутствует..Глицерин-аспарагиновый агар. Рост плохой. Обратная сторона субстрат- ного мицелия желтовато-розовая до , красновато-коричневого. Воздушный мицелий ограниченный, белый, растворимый пигмент отсутствует.Пептон-дрожжевой экстракт - желез ный агар. Рост плохой, складчатый. Обратная сторона мицелия интенсивно красновато-оранжевая. Воздушный мицелий отсутствует, растворимый пигмент слегка желтовато-оранжевый Тирозиновий агар. Рост плохой.Обратная сторона субстратного мицелиятемно-красная.Воздушный мицелий,ограниченный белый, растворимый пигмент отсутствует.Глюкозо-аммониево-солевой агар.Рост плохой. Обратная сторона субстратного мицелия красновато-коричневая. Воздушный мицелий ограниченный, светло-серый, растворимый пиг 10.мент отсутствует.Агар Беннета. Рост умеренный.Обратная сторона субстратного мицелия красновато-коричневая. Воздушный мицелий ограниченный серовато 15 розовый, растворимый пигмент отсутствует.(Культуральные признаки наблюдавются после инкубации при 37 С в течение 3-х недель),Биохимические свойства.Нитрат и нитриты восстанавливаютказеин в агаровой среде гидролизуетслабо, Снятое молоко коагулирует.Желатин не разжижает. Сероводород иэ2-цистеина образует. Меланоиды не2 э г.образует. Реакция на каталазу положительная, реакция на оксидазц положительная,Хорошо утилизирует глицерин,Р-ксилоэу, Р-рибозу, 2-рамнозу,З 0 Р-галактозу, Р-фруктозу, Р-маннозу,Р-маннит, усваивает Р(-)-арабинозу,2(+)-арабиноэу, Р-глюкозу, целлобиоэу, трегалозу, растворимый крахмал,инозит, целлюлозу, хитин, кератин,35 очень слабо утилизирует лактозу, мелибиозу на среде Придхэм - Готтлибас добавкой 0,1 дрожжевого экстракта , не усваивает 2(-)-сорбоэу, сахарозу, рафинозу, Р(-)-мелецитозу,40 дульцит, Р-сорбит, салицин,Способ осуществляется следующимобразом.Для получения противоопухолевогоантибиотического комплекса ВВМ 45 штамм актиномицет 6-455-101 культивируют в водной среде, содержащейассимилируемые источники углерода иазота в условиях аэробного погружения до накопления максимальной ан 50 тибиотической активности.В качестве источника углерода всостав среды могут быть использованыкрахмал, глюкоза, декстрин, мальтоза,лактоза, сахароза, фруктоза, манноза, мелассы, глицерин и другие. Вкачестве источника азота можно использовать протеин, белковый гидролизат, полипептиды, аминокислоты,жидкость от замочки зерна, казеин,мочевина и другие, а в качестве60 минеральных солей в состав питательной среды могут входить анионы икатионы, такие как калиевые, натриевые, аммониевые, кальциевые, сульфатные, карбонатные, фосфатные, хло 65 ридные, нитратные и другие,999981 5 10 15 20 25 понент ВВМА ВВМВ ВВМС 0,48 ВМ53 Культивирование можно осуществлять при 20-45 С, оптимальная температура культивирования 28-34 С,предпочтительней 30/32 С.Максимальное накопление антибиотика обычно достигается примернона 4-6 сут,культивирования . Культивирование осуществляют в условияхаэрации и перемешивания. При необхо-димости можно вводить пеногасители,такие,как силиконовое масло, соевоемасло и лярд.Антибиотическую активность .определяют с помощью агародиффузионногоанализа на бумажном диске с использованием в качестве тест-культурыЯатс 1 па 1 цТеа, рН 9,0.Комплекс ВВМ"928 выделяют из.Ферментационного бульона с помощьюобычных средств, например, путемэкстракции растворителем очисткуосуществляют препаративным противо"точным распределением и хроматографически,П р и м е р 1. Получение комплекса ВВМ, Агаровая Фермен.тацйя. Хорошо выросший агаровый косяк штамма Ас 4 ллоеадога.ьрес е 9С"455-101 используют для инокуляциивегетативной среды, содержащей 2,растворимого крахмала, 1 глюкозы,0,5 Фармамедия ( фармацевтическаясредами, 0,5 дрожжевого экстракта,0,5 М 2-амина (тип .А) и 0,1 карбоната кальция, при. этом рН доводятдо 7,2:перед стерилизацией,Посевную культуру инкубируют при32 С в течение 72 ч на вращающемсявстряхйвателе (250 об/мин), и 5 млростовой культуры переносят в 500 млколбу Эрленмейера, содержащую 100 млФерментационной среды, состоящей из2"растворимого крахмала, 1 фармаИасреды, 0,003 Еп 504 7 Н О и 0,4карбоната кальция.Максимальное накопление комплексаВВМобычно достигается примернопосле 5-дневного встряхивания культурыеФерментация в танке. Посевную культуру встряхивают в течение 4 дней вколбах Эрленмейера и инокулируют в 100 л среды для прорастания, состо" ящий иэ 2,0 овсяной муки фирмы Квакер Продактс. Австрия), 0,5 глюкозы, 0,2 сухих дрожжей, 0,0008 МпС 12. 4 НО 0,0007 Сц 504 7 НО, 0,0002 Еп 5047 НО и 0,0001 Ре 504 ЙО в 200-литровом танковом ферменторе для посева, в котором осуществляют перемешивание при 200 оборотах в минпри 30 фС в течение 54 ч,.15-литровую порцию посевной культуры затем инокулируют в 170 л ферментационной среды, содержащей 2,0 растворимого крахмала, 1,0 Фармасреды 0,003 гептагидрата сульфата цинка и 0,4 карбоната кальция в 400-литровом танковом ферменторе, который работает при 30 фС при 200 оборотах в минуту при скоростиаэрирования 150 л/мин, Величина рН бульона постепенно увеличивается по мере прохождения процесса Ферментации и достигает 8,4"8,5 спустя 100-120 ч, при этом за этот период времени достигается пик антибиотической величины равный 30 мкг/мл.П р и м е р 2, Выделение комплекса ВВМэкстракцней растворителем. Собранный бульон (170 л, рН 8,5)по примеру 1 фильтруют с осветлящщимагентом, Находят активность как в З 0 мицелиальном осадке на Фильтре, таки в фильтрате. Мицелиальный осадокэкстрагируют дважды растворителем,представлякщим смесь ацетона и метанола (1:1, 30 л х 2). Экстракты объ единяют и упаривают при пониженномдавлении, получая водный концентрат,который экстрагируют н-бутанолом.Бульонный фильтрат экстрагируют дважды н-бутанолом (40 л х 2). Концент рирование объединенных н-бутанольныхэкстрактов при пониженном давлении илиофилизация остатка дает неочищенное твердое вещество (21,4 г). Соласно данным анализа тонкослойиой 45 хроматографии данный материал представляет собой комплекс, состоящийиз трех главных компонентов, А, В йС, и трех второстепенных компонентовР, Е и Р, имеющих величины КЕ, представленные в табл. 1.Таблица 1,3 Обнаруж хХ (симадз Хн-Бутан Ксилол -ние с помощью уф развер С) при 345 см, л-метанол-вода (63:27:1 етилэтилкетон-метанол ( вателя:5:1 ВВМ.Неочищенный комплекс, полученный. по примеру 2, очищают с помощью устройства для препаративного противопоточного распределения (Митамура, 100 мл/трубку) с использованием системы растворителей: четыреххлористый 25 углерод-хлороформ-метанол-вода (5;2;5-1). После 50 переносов соде жимое трубок 5-20 объединяют, полу бледно-желтый порошок(4,4 г), сод жащий компоненты А, В, О, Е и Р. Данную смесь растворяют в небольшом количестве хлороформа и пропускают через колонку из силикагеля С500 Ьл), которая предварительно пропитывается этилацетатом. Колонку 3 проявляют этилацетатом с увеличивающимся количеством метанола (2-5, объем/объем) и фракции дозируются по оптической плотности при 345 нм, Первым элюируется этилацетатном вторич 40 ный компонент П, а затем компонент А. Компоненты Е, В и Е элюируются следу. ющими в указанном порядке при концентрации метанола 3. Каждую фракцию, содержащую соответствующий компонент, упаривают при пониженном давлении, и остаток кристаллизуют смесью хлороформа и метанола. Аналогичным образом сырой препарат компонента получают из трубок 21-35 при вышеописанном противопоточном распределении. Очистку компонента С осуществляют с помощью хроматографии на силикагеле и кристаллизации из хлороформа-метанола.Выходы компонентов А,В, С, П, Е и Г составляют соответственно 988 мг, 420 мг, 848 мг, 130 мг, 119 мг и 114 мг.Пример 4. ьная очистка компоне 8 Л примера 3.Анализ тонкослой ографии компонента ВВМ- ера 3 (с применением сист щей . йз 10 метанола в т казал,чая ер 30 5 с 6Молекулярный вес ВВМр, определенный с помощью Полесой Десорбционной Масс спектрометрии, составляет 1427 что соответствует эмпиРической фоРмУле (4 Н 7 ВИ 4 04(МВ 1427, 417) .Элементный анализ (образцы, высушенные при 100 фС в течение 18 ч):Найдено (среднее от трех определений), : С 53,85, Н 5,51, М 13,740 (по. разнице) 26,90.С 64 НВИИ 04Вычислено, : С 52,47; Н 5,48,И 13,81, 0 (по разнице) 28,24.Физико-химические свойства компонентов ВВМА, В, С и -Р.60ты ВВМ Р реакциидругом. Дополнител нта ВВМИндивидупоказывают окрашивания Например, о б 5 хлороформе альные компонен астворимость и сходные друг с и легко раство метиленхлоридной хромат 928 А прим еви, состоя олуоле) йо легка м е р 3, Очистка комплекса что образец не был полностью гоиюгенным в. связи с тем, что он содержит дополнительный материал, идущий непосредственно перед компонентом ВВМА. Для достижения очистки осуществляют следующие стадии.Стадия 1. Образец хроматограФируют на силикагеле с использованием линейного градиента хлороформа до 6 метанол-хлороформ, фракции, элюирующие между 2,4 и 3,3 метанола-хлороформа (содержащие компонент ВВМА плюс какую-то примесь) направляются на следующую стадию.Стадия 2. Создается вогнутый градиент с использованием трех сосудов, из которых в первых двух содержитя 2 метанол-толуол, а в третьемметанол-толуол. Состав из стадии 1, хроматографированный (колонка из силикагеля) на данном градиенте, дает второстепенный компонент, который элюируется первым, с после-дующим элюированием почти сразу за ним очищенного компонента ВВМА (упоминаемого здесь как ВВМА р)10 999981 тельные реакции с реактивами Толленса, Сакагучи и нингидрином.Характерные физико-химические свойства компонентов ВВМпоказаны в табл. 2,Т а блица 2 Свойст 224-22 6-248 Точка плавлени 4421 4-2(Эосмометр,есНС 1 )4 4 молярных эквивалента ацетильныхгрупп. Три продукта ацетилирования,полученные таким образом, обнаруживали идентичные свойства по даннымТСХ, Уф, ИК и ЯМР спектров, что О указывает на то, что ВВМА является моноацетильным производнымкомпонента ВВМВ н диацетильнымпроизводным ВВМС.Кислотный гидролиз ВВМ5 вал пять растворимых в н-бут Спи ЦВМ, гом,эаключных г 8 А дааноле растворимы, в бенэоле, этаноле, метаноле и н-бутаноле и нерастворимы в воде и н-гексане. Положительные реакции получаются с хлорным железом и реактивами Эрлиха, а отрицатиловом спиртероокиси натрия ектры ЯРМ.ВВМА, ВВМВ-928 С очень сходны друг с друпри этом единственная разницаается в присутствии ацетильрупп в компонентах Аэ( :2,03 миллионных долей, 2 мол,эквивалента и В ф:2,05 млн.долей, 1 мол.эквивалент), но не в С, С помощью ацетилирования уксусным ангидридом в пиридине .в компоненты ВВМА, В и С вводятся соответственно 2,3 и 345 (163) 234(556) 264(446) 349 (188) 230(530) 256(775) 330(116) 234(650) 264(442) 345(173) 230(580) 256(704)999981 12 НПВНПВНПВНПВНПВ0,72 0,49 0,46 0,45 0,23 Идентификация ИО ОИ.СО и Фрагмент у СнС-ОИ13 О-СО-СН-Ф-СО-СИ ИИСй Сй СиЦ Со- ИИ- СН- СО Ий 1 У, Сер. л 1, НИ-ча 1 1 У, Сер, НИ1 У П НМ-уа 1. Серии М-т а 3 тилвали Ы-м за аркозин УФ-поглощающих фрагментов (1, П, И, 1 У, и У).и пять растворимых в воде нингидрин-положительных веществ НПВ, 2, 3, 4, н 5 . После 1 ние вещества разделяются с поможете хроматографии на Дауэкс 50 х 4 и идентифицируются как следующие аминокислоты:МСоединения йЕ (5-18)-Окси-Й-метилвалин(Н - ЪР)Глицин(Гли)цЬуСерии(зег)Саркозин(сар)"ТСХ, силикагельная пластинка.8-123:10 ацетат аммония-метанол10-ный раствор аммиака (9:10:1).Показано, что пять УФ-поглощающих фрагментов упоминаемых выше,имеют следующие структуры:Фрагмент 1.С 4 Н,4 й 0 МСг в/е 306 Щ )Лмокс 227, 233, 251, 345 нм,Сн огМ СО-Эи-Си- СО ИНри кислотном гидролиэе (6 Н НС 1)Фрагменты 1, П, Ш и У давали следу Фрагмент ПСН 2, чоМС; и/е 377(М +58)меонЛ 229, 234, 261, 345 нм,5максСйин ОнсиР Он О-СО-СН с10Со-нн -сн-го ифрагмент Ш15о 230, 2 З 5, 262, З 45 им. Сй О ОИсо- (юрФрагмент 1 УЙаУ 0,МС м/е 205(М )25 меОИЛ228, 260, 354 нм.14 13 999981 С О ОН со зеа х уйти юч. нм-иоР И фрагмент 1 У,0Обработка фрагмента У 1 0,1 н. НС 1 при 110 С в течение 1 ч дает фрагмент УП плюс НМ-ча 1 сизо Он35сочеч х Иу-ьо представленный следующей тетрагидро-пиридазиновоЧ структурой 20- уР ос нц-чоРНО ОСНОВ0Оьею Со нн- чаР-зач -яу. с Активность индукции пробактериоФага определяется для компонентов ВВМна лизогенной бактерии (1 ЬВ) До концентрации 100 мг/мл в случае компонентов ВВМА, В и С не было продемонстрировано никакой значительной 1 ЬВ активности.Нротивоопухолевая активность.Сравнительные испытания компонентов А, В, С и Р ВВМс митомицином С на противоопухолевую активность осуществляется с интраперитональ. но имплантированными опухолями: Р 388 лейкемия, Ь 1210 лейкемия, В 16 мела нома, легочная карционома Льюиса (ЛЛ) и саркомный асцит 180 (8180) . Испытываемые растворы компонентов ВВМв 0,9-ном физиологическом растворе, содержащем 10 диметилсульфоксида, и митомицина С в 0,9-ном физиологического раствора вводились раз в день в соответствии с.дозировочным графиком, изменяющим ся от обработки единичной дозой в день до многократного ежедневного лечения. С помощью варьирования дозировок определяетсяминимальная эффективная доза (МЭД), которая дает среднюю величину времени вы живания по крайней мере в 1,25 раза большую, чем контрольная группа. зег серинв 1 у глициньаг саркозин ВВМ, Ас,Ас ВВМВ Ас Н НМ;уа 1 -окси-И-метилвалин ВВМС Н НАнтимикробная активность.Антимикробная активность компо нентов ВВМопределяется по отношению к множеству бактерий и гриб ков по методу серийного разбавления агара на питательном агаре при рН 7 с использованием мульти-инокулирующего устройства Стиир а. Размер инокулюма стандартизирован для при.менения 0,0025 мп количества испытываемых организмов, содержащего приблизительно 10" клеток-мл для всех бактерий и грибков, эа исключе. нием кислоустойчивых бактерий, для которых используется 10 клеток/мл, Минимальную ингибирующую концентрацию. АМИК ), определяют после инкубирования в течение ночи при 37 С. ВВМ60 компоненты являются от умеренно до слабо активными против грамположительных и кислотно-голодающих бактерий, но практически неактивны против грам-отрицательныхбактерийи грибов 65 Ридролиз ВВМА или ВВМС с помощью 0,1 нОм, гидроокиси натрия при 25 ф С в течение 3 ч дает Фрагмент У 1 (сокращения зег, НМ-ча 1 СИ 3 г со еи заг имеют значения, укаэанные выше.и д 1 у представляет глицин, а символ Х представляет неидентифицированную часть. На основании результатов вышеописанных опытов по разложению, спектральных данных, микроанализа и определений молекулярного веса, считается, что следующие структуры наилучшим образом представляют ВВМА, В и С999981 формула изобретения Составитель Г, Смирнова Редактор Г,Волкова Хехред Т,фанта КорректорИ. ВатрушкинаЗаказ 1189/80 Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Считается, что эта степень активности является мерой значительной противоопухолевой активности. ВВМАявляется заметно более активным,чем миномнцин С, при этом Факторувеличения составляет 10-300 в зависимости от штамма опухоли и доэировочного графика. Интрапернтональные величины ЛВо компонентовВВМА, В, С и П и митомицина Сопределены по,методу Ван дер Вэрдан а 10ЛтсЬ.Ехрг.расЬ,рпагваМ 195, 389(1940),Предложенный способ позволяет получить новый антибиотичеекий комплекс,обладающий высокой противоопухолевойактивностью. Способ получения антнбиотическогокомплекса, обладающего противоопухолевой активностью, о т л и ч а ю .щ и й с я тем, что штамм АсС 1 повайцга зр. С -445-101 выращивают в жидкой питательной среде, содержащейисточники углерода и азота в аэробных глубинных условиях с последующийвыделением антибиотического комплекса и/или разделением его на компо-.ненты А, В, С,В , Е и Г.Йсточники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Яйо 3 1, е 1 а 1 . С .Апс 1 Ь 1 оС 1 еэ,14 А, 335, 1961.