Способ получения биомассы микроорганизмов

(23) Приоритет - (32) 07.01.74 Гвсударстввннь номнтвт Совета Миниотров СССР по делам изобретений н открытий(3) 678/74 (ЗЗЪ Великобритания (43) Опубликоваио 16.07.78 Яеоллетеиь26 (45) Дата опубликования описания 06.09.78Иностранцы Дэвид Эрнест форестер Гаррисон, Джон 1 арри Хврвуд и Барри Нейл Герберт(Великобритания) Иностранная фирма Шелл Интернэшнл Рисерч Маатсхаппий, Б. В."(54) СИОСОВ ПОПУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ Изобретение относится к вопросам технической микробиологии, а именно к. способам получения биомассы.Многие микроорганизмы обладают спо 5 собностью уФилиэировать углеводороды в качестве источника углерода и образовывать биомассу, представляющую собой од ноклеточный белок или протеин, который может быть использован в качестве источЮ ника пищевых продуктов, Особый интерес представляют микроорганизмы, способные использовать газообразные органические соедйнения, содержащие в молекуле один или несколько углеродных атрмов, например метан. Известен способ получения биомассы микроорганизмов, согласно которому осуществляют культивирование в аэробных условнях в присутствии газообразного метана на жидкой питательной среде, содержащей источник азота и минеральные соли, метаниспользующего микроорганизма рода МЕОт 10 птапаВ в присутствии, мета нолиспольэуюшего микроорганизма, относящегося к роду РьеОфркоиае.Однаковыход, получаемый при осуществлении известного способа йедостаточно высок.Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Цель достигается тем, что в качестве метаниспольэующего микроорганизма используют. штамм Мат. И со тйо ка в М бТ В М 11084, иэ микроорганизмов рода РВЕцдОтКОПаВ используют штамм Рвецдо 1 итопав И СХВ 1112, при этом эти оба микроорганизма культивируют в присутствии по меньшей мере одного иэ неметилотрофных . микроорганизмов, являюшитеся видовыми обраэпами рода тйеидоптОКОЬе а именно штаммГС 1 В11062, 11063 или 11065, или рода МСОЬОСМИ Отк штамм К С 1 В11061, которые способны метанизировать органические вещества, полученные метан-и/или метанолиспольэуюшими микроорганизмами.7 Очвстве источника белка, добавляемого вкорма животным или при приготовлениипродуктов питании людей, .П р и м е р 1. Выделение культурыбактерий,. выращиваемых на метане. Смешаннук культуру бактерий, растущих намвтане, выделили из образца почвы (гр%эи), взятой на тропической утиной ферме,и 2 г образца поместили в колбу-качалкуна 250 мл с 25 мл среды 38 М. В среду подавали дважды в день газовую смесь,состоящую иа 25% метана и 75% воздуха.Колбу инкубировали на ротационной качалке с орбитальным радиусом 2,5 см при200 об/мин в течение 1 нед. Культуру,в которой появилась мутность, пересеяли,взяв 2 мл инокулюма, в аналогичные колбы-качалки в асептическнх условиях. Операцию повторили несколько раэ и по получении репродуцируемого роста культуры(ТЗ) иа колб-качалокиспольэовали дляинокуляцни ферментера . описанного в примере 5, Среда Э ВМ состоит из штаммаМВЬОФОИ 48 М О В % 11084, штамма РВЕИООааИО 84 Ю С 1 В М 11112 иштаммов РаещоюО пав М С 1 Вй 1106, 11063 ИЯСОЬОСЫйца МСЫВ 11061,П р и м в р 2. Микробиологическиехарактеристики культуры ТЗ.В состав культуры входят следующиемикроорганизмы:Метаниспольэующий микроорганизмЯМЗ М С В й 11084 обладает несколько изменчивой морфологией, имея вид коротких палочек, или кокковых палочек свнутренней мембранной (оболочковой) структурой, группированной параллельными складками в клетке. Этот микроорганизм растет в одиночестве на метане лишь медленно. На основе приведенного выше описания этот микроорганизм является ранеенеописанным аидом типа МЕ 11 ОЕОйавЦС 1 В а 11084.Метанолис пользующий, микроорганизм,.обозначенный ОМ Ь М С)В В 11112.характеризуется способностью расти и образовать колонии лишь на агаровых пластинках, содержащих метанол в виде единственного источника углерода, Рост неимеет места в присутствии глюкозы, лактоэы, сахаровы, маннита, ионзита, цитрата или питательного агара. Микроорганизмоколо 2 мкм длиной и 1 мкм Ьириной,с одним полярным жгутиком. Колонии наагаре однородные (гладкие, ровные и се.рые со сплошными краями (не прерываемыми) и появляются на агаровых пласти 3 6158 4Согласно этому способу во время егоосуществлении поддерживают температуру38 45 оС, а рН 6,4 7,4.1Преимуществом етого способе, кромеповышения выхода целевого продукта яв- уляется повышение устойчивости к инфеквиям и уменьшение пеиообраэования.Используемыв микроорганизмы выделе.ны из природных источников,Источником азота жидкой питательной, 1 осреды являются аммиак, мочевина, аммунийные соли, например сульфат, хлоридили нитрат, например нитрат щелочного .металла.Кроме того, в ней содержатся источни.6ки фосфора, серы, магния и железа, Источ-фником фосфора служат. фосфапа, напримерКНРЯ, Кн РО МаРО илн(ЮД 8 РОрили фосфорная кислота, предпочтительно,в концентраций 3-20 г/ч, 33Источником серы может служить серная. кислота или сульфаты, например сульФфат аммония, в концентрации 0,5-5 г/л.Используется семиводный сульфат магния в концентрации 0,2 2 г/л и шестивод 2ное хлорное железо в концентрации 0,01-0,1 г/л,В среде могут содержаться следы других элементов, например соли кальция,марганца, цийка,.кобальта, молибдена и Зобора.Способ можно осуществлять периодически и непрерывно.Среду,контактируют во время выращивания микроорганизмов с газовой смесью фсодержащей метан и кислород, В качествасточника метана можно использовать прн.родный газ,Непрерывный способ осуществляется вфермвнтере с лопастной мешалкой или в 4 Оферменте колонного типа с разбрыэгиванивм, снабженном рубашкой охлаждения.Скорость притока среды при осущесчЗщении способа равна скорости отвода куль-туральной жидкости и составляет 0,0241,ОО объема культуры в час.Газообразную смесь метана. и кислородом непрерывно барботирувт в питательядо срвдуеОтработанный газ выводят из верхнейчасти фврмвнтера.Клетки микроорганизмов (биомассу) отобирают иэ питательной среды известными.способами, например седиментапией, осаж-.дением с последующей фильтрацией.БПолученную биомассу сушат вымораживанием или распылительной сушкой. Полрнах с метанолом/минеральными солямипосле 2 дней инкубации при 42 оС, На основании описанного вьгше микроорганизмможно отнести к ранее неописанным видамтига 7 ееи 3 аеаггав. Ц СВ11112.Прочие типы микроорганизмов вы5делены из смеси, которая не можетрасти ни на метане, ни на метано,ле, как единственном источнике углерода, Они получили обозначение М,М 2, М и М 4. Они были подвергнуты стан.10двртным испытаниям или тестам для определения того, к каким микроорганизмамони относятся.Результаты атих тестов приведены втабл, 1 н 2. 5На основании приведенных результатов(полученных при указанных тестах) можно сделать вывод об идентичных микроорганиэмах. Организм М 1 является видом7 ВЕиОовоиов й СВ11062.Микроорганизм М 2 является видомМСОООСЫ 1 и ГГ Ц С В11061, микроорганизм М- видомР 98 Ос 10 ФО тОВЙ СВ11063, микроорганизм Мд видом Рбеи со гИ оП а е Я СВ11065.П р и м е р 3. Культуры вырвщйввлииз семей, следующих бактерий:МЗ (растут лишь на метане)БОМ (растут лишь на метаноле)М Ь (неметилотрофная бактерия)М 2вМБМ 4ВПриготовили питательную среду в соогветствии с описанным Шиханом и Джонсоном (далее обозначаемая как среда 1 ЯМ),содержащую следующие ингредиенты, г/л;МН 2 РО1 нЙ1,16Май 0 1,18М 804 7 НО0,08Г е 80, 7 Н 20 0,014Са (Оз )4 Н.0 0,025СИВО 5 НО 8 Х 102180 7 Н О4 268 10Мггб 044 НО 6,0 10И вйо 04 2 НО 48 10 УКультуру выращивали в стерильных стеклянных сосудах емкостью 500 мл, черезкоторые непрерывно барботироввли смесь50метана с воздухом,Аппаратура представляет серию сосудов,через которые непрерывно через эинтелзольный фильтр барботировали смесь ме 55тана и воздуха в соотношении 1:3, Черезотверстия в сосудахосуществляют инокуляцию и отбор проб.Колбы инокулироввли 1,5 мл своейкультуры ( 24-часовой) каждого иэ 4 мик60 рооргвниэмов, обозначенных М, М, М и М 1. Вносили по 4 мл обоих метаниспользующих (б МЗ) и метанолиспользующих (ОМЕ ) бактерий из 2 3 дневных культур, выращенных в колбах-качалках на среде 18 М.Среда в сосудах представляла собой 400 мл среды;18 М, описанной выше а рост определяли измерением оптической плотости (ОД) при длине волны 625 нм,Результаты приведены в табл. 3. Эти результаты показывают, что для обеспечения лучшего роста на метане необходима смешанная культура. Ситуация несколько улучшается в присутствии метанолиспользующих, но для лучшего роста необходимы все компоненты (смешанной культуры),Эти результаты являются средними от трех экспериментов, из которых каждый повторяли двв-три раза.П р и м е р 4. Эти аксперименты имели целью проверить, можно ли заменить компоненты культуры ТЗ другими микроор ганизмами, обладающими аналогичными функциями. Культуры в барботируемых стек" лянных сосудах те же, что ив примере 3, ио в некоторых случаях метанолиспольэуюшие микроорганизмы из культуры ТЗ заменяли метанолиспользующими микроорганизмами штаммаСВ11040, Ана логичным образом неметилотрофические компоненты ТЗ заменяли неметилотрофическими микроорганизмами М СВ11018, 11020, 11021, и 11022. Результаты приведены в табл. 4.Разница между цифровыми значениями в вертикальных колонках 6 в табл. 4 невелика. Можно поэтому заключить, что метанолис пользующие микроорганизмы ИС;1 В11040 можно заменить ОМЬ, Неметалотрофные компоненты взаимозаменяемы.П р и м е р 5. ферментация с использованием культуры ТЗ.Культуру выращивали непрерывным способом на минеральной среде, метане и воздухе, Использовали при атом ферментер Биотек емкостью 2,5 л. Метан и воздух распределяли в жидком содержимом иэ расчета 150 и 450 мл/мин соотвев ственно. Температуру среды поддерживали около 42"С, а рН около 7,4, Среду перемешивали мешалкой со скоростью 1000 об/мин. Давление в ферментере было чуть выше атмосферного.Используемая для непрерывного культи вироввния жидкая среда, обозначенная 53 содержала;К 1 Р 04 г/л 1,6 М аНРО 4 г/л 1,1670 Таблица 1етан бактерий, содержащихсяесты первой стадии ест лочка лочк ование спор одвижность и помощи полярного жгутика 7 61588 а ИО, г/л 3 е 18МВО7 Н О, М 0,107Ре 50,(7 НО, Ф/л0,009Са (МО) 4 НО, гlл0,06Раствор микроэлементов, мл/л1Концентрированная, кислота,- мл/л 0,33Дистиллированная вода,до л 1Использованный раствор микроэлементов имел следующий состав, г/л;СиаоА 5 Н о 33047 НО 0,336миво 4, 4 НйоЧфо 04 2 Н 0 0,21315СОИ 4 6 НО 0,015Этот общий раствор добавляли к остамку среды в концентрации 1 мл/л.В ферментер внесли 2 л среды и культуру 1 М, перемешивали при аэрации и 20подавали метан. Инокулировали 100 м,".выращенной в колбе-качалке культуры ТЗ.После обнаружения роста в ферментере добавляли среду 5 ( из расчета 0,08 ч(степень разведения); Ееповышали на0,02 чс двухдневными интерваламидо 0,22 ч" без промывки культуры.Были достигнуты равновесные состояния,при которых концентрация биомассы находилась в,интервале 2,5-6 г/л. Это, невысшая концентрация биомассы при непрерывном выращивании. Культуру выращиыли непрерывно в течение более 3000 ч.Микроорганизмы собирали и анализировали результаты,. Г 5 При любом состоянии равновесия и данной степени разведения при непрерывном выращивании процент обшей популяции бак-. терий, представленных любыми видами, не изменялся. Кроме того, культура очень устойчива к инфекциям чужими микроорИдентификация не использующих мв смешанной культуре ТЗ. Т ганизмами, так что загрязнения нельзябыло обнаружить даже при заражении культуры инородными микроорганизмами.П р и м е р 6. Смешанную культуру метаниспользующих бактерий выращивали непрерывным способом в ферментереемкостью 300 л в условиях, в основномэквивалентных указанным для ферментациив небольшом масштабе. Клетки собиралифугованием и сушили методом распылительной сушки. Получили свободно-гекущийбез цвета и запаха порошок (ВСР), состоящий из сухих бактериальных клеток ссодержанием протеина 78%. Порошок испытывали на крысах следующим образом.ЯСР давали крысам отъемышам в течение 10 дней так,.что ВСР представлялединственный .источник белков в диете. Каж.дый опыт контролировался контрольнойдиетой, в которой единственным источником белковв служил казеин. Для сравнения давали сель,дяную муку - один их богатейших белкомвидов кормовых добавок (для животных).Общее, содержание протеина (М х 6,25)в каждой диете равно 10%, прочие питательные вещества давались в количествах,соответствующих оптимальному росту.Результаты экспериментов с питаниемпредставлены в табл. 5,Из табл. 5 можно заметить, что 8 СР,полученный из смешанной культуры бактерий, растущих на метане, является удовлетворительным видом белков. Несомненноон луше сельдяной муки в качестве диетического компонента при откорме животных.Лминокислотный спектрСР подвер"гали анализу, результаты приведены втабл. 6. Эти результаты указывают, чтоаминокислотный баланс таков, что позволяет признавать ЯСР весьма подходящимв качестве протеинового корма для живоъ.ных,615870 Продолжение табл,Образованиекаталазы Активность оксидазы Использованиеглюкозы (кисл.) Тест 0 - (Хуга иЛейфзона ) Окислительный Окислительный Кислотост ойкость Нестойкий Тест Активность уреазы Использование цитрата Гидролиз желатиныОбразование индола Реакции на Мр (метилрот) и Ч Р (Вогез-Проскауара) ГлюкозаЛактоза (кисл,)Сахароза (кисл)Маннит (кисл.) л(ест) Мальтоза (кисл.)Рост на питательномагареАктивность катала зы Слабо Слабо Восстановление нитрата Таблица 2 Идентификация не используюших метан бактерий, содержащихся в смешанной культуре ТЗ. Вторая стадия испытаний615870 Таблица 3 Рост на метане после 3 дней при использовании различных сочетаний бактерий, содержащихся в культуре ТЗ.ечание, Знак + обозначает соде знак - обозначает отсутс 43 аэеин 0,256 2,5 0,2 льдяная,2 ВМЗЯМЗ, ОМЬ Повышение оптической смешанных культур,. в значения 2 Эксперим повторяли четыре,Тплотности (при 625 нм) различныхрашиваемых на метане (средниертов, иэ которых каждыйраза для каждой культуры )615870 Габлица 6 Аминокислота 8,48 4,00 3,30 4,18 5,91 0,31 2,78 4,50 7,02 5 е 43 2,00 5,84 Аспарагиновая кислотаТреонинСерииГлутаминовая кислотаПр олинГлинн нАланииВалинЦистин (1/2)МетионинИзолейцинЛейцинТирозинФенилаланинАммиакОмитинЛизинГистидинАрг инин% Ц % мlмНеочищенный протеин Формула изобретения1. Способ получения биомассы микроорганизмов, предусматривающий культивирование в аэробных условиях в присутсэ В вии газообразного метана на жидкой питательной среде, содержащей источник азота и минеральные соли, метаниспольэуюшего микроорганизма в присутствии метанолиспользующего микроорганизма, относящегося к роду РЕецдоааИае, о тл и ч а ю ш и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве метаииспольэуюшего микроорга60 низма используют штамм ИВЮЗОФОйО 6С В М 11084, из микроорганизмов родаРбео 30 що Иа б используют штамм РаЕОИОаокде Мс:1 В М 11112, при этом последние культивируют в присутствии по меньшей мере одного иэ неметилотрофных микроорганизмов, предпочтительно штаммов Раеидо 1 иопав Я С 1 В М 11062,Рвецдощопаб МСЗВ Я 11063, Рвеидоеа пав ИС В Мй ИОЬб МСояс 1 вйцт М С 1 В % 11601,2,Способ по п.1 о т л и ч а ю ш и й ; я тем, что температуру культивирова15 615870 16ниа поддерживают в интервале 38 45 оС. Источники информации, принятые во вйимание при экспертизе: 3. Спжоб по и. 1, о т л и ч а ю щ и йс и тем, что рН регулируют в интервале 1. Патент Великобритании М 1270006,кл. С 6 Р, 1972.Составитель М, АндрееваРедактор Т.,Деватко Техред Н. Бабурка Корректор И. ГоксичЗаказ 3802/48 Тираж 568 Подписное ЦНИИПИ государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушскан наб., д, 4/5 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4