Способ получения метан-окисляющих бактерий

Союз Советских Социалистических Республик(23 32) 15,09,70 орите твенкык кометМкнкстрав СССм кзобретекнйоткрытий ос 5589,4 (33) ФР авета ке де 43) О(088.8) бликоваио 15,07,78,Бюллетень2а опубликования описания 06.09.78 ИностранцыЮрген Овербзк (ФРГ) и Моннр Нагуиб (Египет 72) Авторы изобретения Иностранная фирмакс-Планк Гезельшафт цур Фердерунг дер Виссеншафтен е.(71) Заявитель ОСОБ ЧЕНИЯ МЕТАН-ОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИ Измикрокроби к технической к вопросам мипротеинов из а получения меспособных пере лок,относится а именно о синтеза ретениеологииогическои касаесляющнхетан в п тся спосо бактерий,ан-окести тщевои бе ый способ ключа олученную бактераальную к считать стабильной, метан н высокоактивной, к тому ее получения сложен. редлага Однак дующем.Образец донного осад еского) пограничного туру нельз специфично сам спосо водного (акваотопа помещают Известен способ получения метан-окисляюших бактерий, согласно которому пробу почвы. вносят в жидкую минеральнуюО питательную среду содержащую двухзамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний и количестве 02 г/л и следы хлорного железа. Культивирование прово дят в присутствии смеси метана и воздуха, взятых в соотношении 1:1. Полученную культуру пересевают на минеральную агаровую среду с последующим культивированием и выделением бактериальной культуры 1,Целью изобретения является упрощение процесса и получение бактериальной культуры, обладающей высокой активностью.С этой целью согласно предлагаемому способу используют пробу почвы, выделенную из донного отложения пограничнэго биотопа, а в жидкую минеральную питательчую среду (на 1 л) дополнительно вносят 1 мл раствора, приготовленного путем смешивания 18 л дистиллированной воды со следующими компонентами, г: хлористый литий 0,5; пятиводный сульфат меди 1,0; семиводный сульфат цинка 1,0; борная кислота 11,0; сульфат аммония 10; гидрат хлористого олова 0,5; шерстив водный сульфат никеля 1,0 четырехвод ный хлористый марганец 7,0; шестиводный нитрат кобальта 1,0; окись титана 1,0 йодистый калий 0,5 и бромистый калий615871 Углеводы: глюкоза фрукт оза галактоэа Фманноза рибоза в жидкую минеральную питательную среду и ведут процесс культивирования, насыщая среду смесью метана и воздуха, взятых в отношении 1 1 (по объему).Для используемого донного осадка пограничного биотопа характерным является5 то, что в нем отсутствуют условия для процесса обмена веществ метан-окисляющего штамма бактерий в силу нехватки, кислорода в растворе минеральных пита 10 тельных веществ.Для приготовления жидкой минеральной питательной среды используют из расчета на 1 л двухзамещенный фосфорнокислый калий; сернокислый магний в количестве15 0,2 г/л и следы хлорного железа, а также 1 мл раствора,содержащего на 18 л дистиллированной воды следующие компоненты, г: хлористый литий 0,5; пятиводный сульфат меди 10, семиводный сульфат цинка 1,0; борная кислота 11,0;суль- фат аммония 1,0; гидрат хлористого олова 0,5; шестиводный сульфат никеля 1,0 четырехводный хлористый марганец 7,0; шестиводный нитрат кобальта 1,0; окись титана 1,0, йодистый калий 0,5 и бромистый калий 0,5.Полученную в результате культивиро вания культуру пересевают (переносят мазки) на пищевую среду-минерально-ага- о ровуЮ и ведут последующее культивирование на ней, Затем выделяют единичные клетки из образовавшихся колоний и их культивируют на питательном растворе, состоящем из минеральных веществ в при- З 5 сутствии смеси метана и воздуха в объемном отношении 1;1. Послеатого выделяют чистые культуры бактерий.П р и м е р 1. Для выделения метанокисляющих бактерий берут 1 г пробы поч-, вы из донного отложения вблизи берега западного побережья Шенэе, в местности расположения института лимнологии имени Макса Планка и вносят ату пробу в жидкую минеральную питательную среду, описанную выше,Полученную смесь культивируют в фероментере емкостью 200 мл при 27 С вгазовой среде, состоящей из одной объемной части метана и одной объемной частивоздуха,По истечении трех дней появилось на питательной среде плотное бактериальное разрастание, обнаруживаемое с помощью микроскопа. Полученную культуру пересевают на минерально-агаровую среду и в течение пятидней продолжают процесс культивированияв среде метана и воздуха, взятых в укаэанном отношении, до образования на поверхности видимых под микроскопом колоний, Из полученной популяции бактерий выделяют единичные клетки в капельках питательной среды. Их обрабатывают указанной смесью метана и воздуха, Спустя пятьдней из находящихся в капельках питательного раствора единичных клеток образовались чистые культуры бактерий (штаммМ 102). Их выделяют известным образом, Установлено, что иэ 1 вес.ч. метанаобразовалось 0,8-0,9 вес.ч. бактериальной культуры,П р и м е р 2. Для получения харак-теристики культуры, полученной в примере1, из соединений, приведенных в табл. 1,готовят субстраты в виде 1% ных растворов в минеральной питательной среде,Полученным субстратом .прививают иопытуемую культуру - штамм Мметан-окисляющих бактерий,Спустя 3,7 и 21 день с начала культивирования проводят испытания. Результаты приведены в таблице. При атом обозначают знаками:- никакого использования субстрата61587 1 Продолжение таблиць,Изменения спустя, день Субстрат 21 проба на метилроткатала зао .сцце "аМЕ СоМе Бг.-.ф.В,(бульон) лакмусовое молоко разжиженная желатина Из приведенных в таблице данных видно, что из всех опробованных питательных сред подверглись значительному распаду 5 (были использованы) жирные кислоты и ряд сред потреблялись слабо, в частности из спиртов-метанол. Это говорит о специфичности испытуемой культурытолько к одному виду, источника углерода - метану, 30П р и м е р 3. Готовят растворы субстратов путем добавки органических соединений в концентрации 1% к жидкой минеральной питательной среде указанного типа; 35 В полученный раствор субстрата засевают испытуемую культуру штамм Ми культивируют при рН 7, температуре 27 С в ферментере при встряхивании.оДля сравнения эту же культуру засевают на аналогичную питательную среду, но без органических добавок, а культивирование ведут в присутствии смеси метана и воздуха, взятых в соотношении 1:1.Пробы отбирают спустя 3,5 и 7 дней. В результате было установлено, что испытуемый штамм М- специфичный в отношении метана.П р и м е р 4. Проводят испытания штамма Мна цветные пробы, Полученные результаты приведены ниже;Проба (тест)Окрашивание:по Граму Отрицательное 5по кислотности Отрицательноеспор Отрицательное жгутиков Отрицательное капсул Отрицательное Таким образом, можно сделать вывод,что в испытуемой культуре отсутствуютакце пторы,П р и м е р 5, Определяют активностьокисления метана штаммов М. Дляэтого в ферментер емкостью 5 л вводят1 л жидкой минеральной среды указанного типа и засевают испытуемую культуру,культивируют при 27 С в присутствиисмеси метанола и воздуха в отношении1:1 по объему. Выход полученной через5 дней культуры составил 1,5 г, что впересчете на израсходованный метан составляет 0,8 вес.ч. культуры на 1 вес,ч.метана,П р и м е р 6. Засеянную по приме.ру 5 среду культивируют з ферментере ем-костью 5 л при встряхивании при 27"Св присутствии смеси природного газе ивоздуха в отношении 1:1 по объему.Концентрация культуры, полученной через 5 дней составила 1,5 г сухого вешества,Культуру отделяют от питательной среды и определяют ее состав. Установлено,что на 70% она состоит (по сухому веществу) из протеина, остальное - углеводы, липиды и составные части клеточныхстенок.Выход культуры в пересчете на метансоставил 0,8 вес,ч. сухой массы бактерий из 1 вес,ч. природного газа, На дыхание израсходовано 20% газа, Это соответствует наибольшему выходу, достигнутому когда-либо.П р и м е р 7, Опыт аналогичен примеру 6, но культивирование ведут в сме, 615си метана и воздуха, состоящей иэ 59 об.Ъвоздуха и 41 об.Ъ метана, В смеси.содержалось 11,8 об.% кислорода (т.е.смесьнаходится вне границ вэрывоопасности),При атом были предусмотрены все друге.меры безопасности, предусмотренные приработе с газом в помещении (снабжениекоммуникаций предохранительными клапанами для избыточного давления, вынос ферментера иэ основного помещения в специ 1 Оальное, установка контрольных и сигнальных приборов и т. д.).Во время культивирования метан и воэдух подают последовательно, точками ссоблюдением интервалов, и зависимости.1от выхода (при выходе 28 г/л относительно сухого вещества биомассы продолжительность подачи газа, мин, интервал выдержкимин.Содержимое ферментера подвергают неОпрерывному днализу, удаляя замедляющиерост продукты.Выход биомассы составил 28 г/л питательной среды,Приведенные примеры подтверждают 25эффективность получения метан-окнсляющих бактерий по предлагаемому способу.формула и зобретенияСпособ получения метан-окнсляющнх бактерий, предусматривающий внесение871пробы почвы в жидкую минеральную питательную среду, содержащую двухэамещеи ный фосфорнокислый калий, сернокислый магний в количестве 0,2 г/л и следы хлорного железа, культивирование ее в присутствии смеси метана и воздуха, вэя тых в соотношении 1;1, пересев получен ной культуры на минерально-агаровую среду с последующим культивированием на этой смеси и выделением бактериальной культуры, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью упрощения процесса и полу чения бактериальной культуры, обладаю щей высокой активностью, используют почву, выделенную из донного отложения пограничного биотока, а в жидкую минералы ную питательную среду дополнительно вно сят иа 1 л питательной среды 1 мл раст .вора, содержащего на 18 л дистиллирован ной воды следующие компоненты, г: хло ристый литий 0,5, пятиводный сульфат ме дн 1,0, семиводный сульфат цинка 1,0, ,борную кислоту 11,0, сульфат аммония 1,0, гндрат хлористого олова 0,5, шести водный сульфат никеля 1,0, четырехвод ный хлористый марганец 7,0, шестивод ный нитрат кобальта 1,0, окись титана 1,0, йодистый калий 0,5 и бромистый калий 0,5.Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе;1. "Микробиология", т. 38, вып. 2,1969 ю с. 251-257.Составитель М. АндрееваРедактор Т, Девятко Техред Е. Давидович 1 Корректор И. ГоксичЗаказ 3802/48 Тираж 568, Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам иэобретеняй и открытий 113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4