Способ получения полисахаридно-белковой вакцины против neisseria меningiтidis серогруппы в

(ю 5 А 61 К 39/095 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ЛЬСТВУ ВТОРСКОМУ СВ вым спирто одукта - ра ЛКОВОГО. КОМ м буфере, 2(504)3.ы. г/л: 0,2 0,001 0,13 0.842 0,716 002 500 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР 21) 4837952/13(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДНО-БЕЛКОВОЙ ВАКЦИ Н Ы ПРОТИВ ЙЕ(ЗАЕВА МЕМЙОТОЯ СЕРОГРУППЫ В Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения вакцин для профилактики менингококковой инфекции,Известен способ получения вакцин про. тив й. гпеппдтОэ серогруппы В, включающий культивирование штамма в жидкой питательной среде, содержащей природное сырье (гидролизат казеина), в условиях аэрации, отделения культуральной жидкости от бактериальной массы, добавление цетавл она к супернатанту, экстракцию полисахариднобелкового комплекса хлористым кальцием, обработку этиловым спиртом с последующим отделением полученного комплекса центри. фугированием, лиофилизацией, гельфильтрацией в присутствии в препарате тиомерсала с последующим добавлением к фракции выходящей в свободном объеме дезоксихолата натрия, стерилизацией через мембраны,(57) Использование; профилактика менингококковой инфекции, медицинская биотехнология. Сущность изобретения; вакцинный штамм культивируют в жидкой синтетической питательной среде экспоненциальным отливно-доливчым методом. К выросшей культуре добавляют цетавлон до конечной концентрации 0,05 - 0.15. Выдерживают до образования осадка, Преципитат отделяют центрифугированием и проводят экстракцию цетавлонового комплекса хлористым кальцием, Экстракты многократно обрабатывают этанолом. На заключительном этапе экстрагированный комплекс обрабатывают ацетоном, стерилизуют и лиофильно высушивают. Полученная вакцина может быть использована для вакцинации лвдей без применения адъюванта, 7 табл. осаждением фильтрата этилоприготовлением целевого пртворения полисахаридно-белекса в натрий-фосфатно5 О-ном растворе лактозы и АСостав питательной средФосфорнокислыйдвузамещенный калий-глутаминоваякислотаЦистеингидрохлоридУглекислый-кислыйнатрийГидроксиметил-метилглицинСернокислое железо7-водноеХлористый аммоний0,090 ф 0,010 Сернокислыйкалий 0,048 Раствор хлористогокальция 0,0074 % 1 мл Гидролизат казеина 0,020 Хлористый магний6-водный 0,107 .Глюкоза 7,500 Культйвировайие менингококка простое - неуйравляемое. Цетавлон добавляется до концентрации 1%. Полисахариднобелковый комплекс обрабатывают дважды 3-мя объемами этанола, Полисахариднобелковый комплекс подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом О:2 В и собирают фракцию, входящую в свободном объеме,Недостатки иэвестйого способа: неуправляемое культивирование не позволяет получать стандартный целевой продукт; необходимость включения в питательную сре"ду природного сырья - гидролизатаказеина, загрязняющего препарат немейингококковыми макромолекулярными соединениями; использование двух разных :детергентов цетавлон и деэоксихолат натрия), а также консерванта тиомерсала, от остатков которого нужно избавляться, как от вредной примеси; использование слож: ного и плохо воспроизводимого процессагельфильтрации, низкая активность получаемого препарата и как следствие этого необходимость его введения совместно садъюнантом (гидроокисью алюминия) дляиндукции синтеза антикапсульйых антител,Таким образом, недостатками известного способа является сложность и низкая активность вакцины.Цель изобретения - упрощение способаи повышение активности вакцины.Цель достигается тем, что культивирование проводят экспоненциальным отлив - но-даливным методомв жидкойсинтетической- питательной среде, содержащей Ь-глутамат натрия, хлористый калий, хлористый натрий, сернокислый магний 7 водный, фосфорнокислый двузамещенныйнатрий 12-водный, цитрат натрия трехэамещенный, глюкозу - при следующем содержании компонентов, г/л:1:глутаматнатрия . 1,300 ь 0,100 1:цистеингидрохлорид 0,030+0,010 Хлористый .калийХлористыйнатрий 6,000 й 1,0001,250+0,010 0,03 ф 0,010 0,09 М,010 6,00+1,000 40 Сернокислый магний7-водный 0,060 ф,010Хлористыйаммоний5Фосфорнокислыйдвузамещенныйнатрий 12-водный . 2,500 й 0,200Цитрат натриятрехзамещенный 0,500 М,10010 Глюкоза,. 1,600+0,200Дистиллирован-.наяаода . До 1,00 лЦетавлон добавляют к выросшей культуре до конечной концентрации 0,05-0,15%,15 выдерживают до образования осадка, аналогйчно приведенному выше способу проводятэкстракцию хлорйстым кальцием,обработку спиртом осуществляют, добавляяего в объеме 0,20-0,30 мл в течение 2-4 ч,20 далее йолученнйй надосадок повторно обрабатывают 0,75-0,85 объема спирта в течение 16-20 ч.П р и м е р 1, Приготовление синтетической. питательной среды.25 Сухая синтетическая питательная средаи редставляет мелкодисперсный порошокбелого цвета. Для приготовления 1 л питательной среды взвешивают (11,75+0,10) гсухой питательной среды следующего со 30 става, г/л,1:глутаматнатрия 1,ЗОБО,100.-цистеин гидрохлорид35 Хлорид калия . .Хлорид натрияСернокислый магний7-водный0,06+0,010Хлорид аммония . 1,25 й 0,010Фосфорнокислыйдвузамещенный нат-,рий 12-водный 2,50+0,200Цитрат натрия трехзамещенный 0,50+О,10045 и растворяют в 1,0 л дистиллированной воды,подогрева 1 от до полного растворения всех. компонентов, устанавливают рН 7,2-7,3 с помощью 30,0 ф 1,0 оНС 1, фильтруютчереэ батистовый Фильтр и разливают мерно в емкости.О Питательную среду стерилизуют при 112 ЫОСв течение 30+5 мин. После стерилизации добавляют стерильный раствор 40+1% глюкозыиз расчета 4,0 М,1 мл на 1,0 л питательнойсреды. В бутыли в стерильных условиях вставляютсифоны, позволяющие стерильно перекачивать питательную среду в ферментер.Приготовление посевной культуры,В стерильных условиях вскрывают ампулу с лиофильно высушенной культуройменингококка штаммов ЬЬ 125 или М 150, 2525% от полного насыщения. Слитую изПастеровской пипеткой вносят в амйулу ферментера культуру собирают в стеклян(0,5 М,1) мл стерильного (0,85.0,01)% рас- ные сосуды,твора хлорида натрия и полученную взвесь Получение цетавлонового осадка,последовательно рассеивают на 3 чашки с 5 К микробной культуре добавляют све 20% сывороточным агаром Хоттингера. По- жеприготовленный 10+1-ный раствор цесевы инкубируют при 37+0,5 С в течение тавлона до конечной концентрации18-20 ч в эксикаторе со свечой. Выросшие 0,10 й 0,05%. Культуру перемешивают враколонии должны быть в Я-форме, прозрач- щением бутыли и оставляют при 20 - 25 С наные с голубоватым оттенком, с ровными 10 2+0,1 ч,За это время полисахзридно-белкокраями и гладкой блестящей поверхностью, вый комплекс с цетавлоном выпадает в осане более 2 мм в диаметре. В мазке, окра- док, и одновременно происходит. шенном по Граму в модификации Калины стерилизация куль 1 урыпод воздействиемкультура должна представлять собой мел- цетавлона.кие грамотрицательные диплококки; Вы Получение полуфабриката вакцины.росшая микробная взвесь должна давать: Цетавлоновый осадок отделяют центриположительную реакцию агглютинации на фугированием при 4 мС при 3000 й 500стекле с коммерческой сывороткой об/мин втечениеЗО+5 мин,промываютдиН,репп 9 Юбз серогруппы В. Культуру, ти- . стиллированной водой, при повторном ценпичную по всем показателям, рассеивают 20 трифугировайии, Осадок взвешивают ина 15 чашек или 3 матраца с 20%-ным сыво- сохраняют при -203:2 С.роточным агаром Хоттингера, инкубируют В дальнейшем осадок хорошо растира. при 37+0,5 С в течение 18 - 20 ч, смывают ют, переносят в химический стакан и пристерильным 0,85 й 0,01%-ным раствором бавляют 1 моль/л раствор СаС 2 вхлорида натрияи помещают в стерильную 25 соотношении 1:10. Экстракцию проводят вколбу с сифоном и используют в качестве " течение 30+5 мин прй постоянном перемепосевной культуры. " .;.:: . шивании на магниТной мешалке. ЭкстрактКультивирование в ферментере,:.; отдел я ют центрифуги рова н ием и риПосевную культуру, находящуюся в кол+100 в течейие 30+5 мин и сливают в. бе с сифоном, присоедийяют к шлангу эабе- ЗО чистый химйческий стакан. Повторяют про-.ва и с помощью резиновой груши через .: цесс экстракции, добавляя новую порциюшланг со стерильным фильтром в ней созда-раствора СаС 2, Полученные экстракты обьют избыточное давление, позволяющее пе- . единяют и добавляют 96 й 1% этанол до корелить содержимое колбы в ферментер. нечной концентраций 25 +5%, перемешиВыращиваниекультуры всинтетической пи- .35 вают и оставляют на 18 - 20 ч при 6 С.: тательной среде проводят при постепенйОм Выпавший осадок отделяют"на центрифугеувеличении частоты вращения мешалки от " при 620 ОЫОО в течение 30+5 мин и отбра 70+10 об/мин в начале процесса до сывают. Кнадосадочнойжидкостидобавля(200+10) об/мин в концеэкспоненциальнойют 96 ф% этанол до конечной. фазы роста (к 7-8 ч роста). К 7-8 ч роста, т.е. 40 концентрации 80.ф.15%. Смесь перемешива:к койцу .экспоненциальной фазы; оптиче- ют и оставляют на 3+0,1 ч, Выпавший оса- .ская плотность (ОД) достигает значений док отделяют центрифугированием при1,5+0,2 ед, по показателяи ФЭКМ или 2600.ф.100 втечениеЗО.ф.5 мин. Этотосадок,46 й 2 единйц мутйости по стайдарту аптиче-. представляющий собой полуфабрикат вакской плотности ГИСК. В этот момент из Фер 45 цины, отмывают три раза 96 й 1% этанолом,ментера сливают половину объема культуры, 2 раза ацетоном и высушивают в вакуум-экси доливают свежей питательной среды доикаторе над прокаленнйм СаСа,прежнего обьема. После долива питатель-,Получение вакцины.ной средой ОД становится равной 0,72+0,1 Готовят 0,2-ф.0,05%-ный раствор полед. или 23 м единицы мутности по стандар уфабриката в 1+0,1% апирогенном раствотуоптической плотности ГИСК. Через 2+0,5 . ре лактозы. для удаления нераствоч оптическая плотность культуры достигаетрившихся частиц раствор центрифугируютуровня, существовавшего до первогосливапри 12000 -1000 об/мин в течение 30.ф.5культуры. Вновь осуществляют слив поло- мин, Надосадочную жидкость собирают ивины обьема культуры и долив свежей пита подвергают стерилизующей фильтрации нательнойсредойдо прежнегообьема, Такиефильтрах "Мроге" с размером порсливы-доливы производят через каждые 0,45-ф,01 мкм, полученный стерильный2,0+О,5 ч, уровень растворенного в срейе раствор вакцины разливают по 1,0+0,1 мл вкислорода поддерживают на значениях стерильные ампулы и лиофильно высушивают. Все эти работы проводят с соблюдениемправил асептики,Характерйстика вакцины.Вакцина представляет собой природный комплекс группоспецифического пописахарида (В-полисахарида) и белковнаружной мембраны менингококков серогруппы В. Препарат имеет вид рыхлого порошка белого цвета. Выпускается в сухомвиде в ампулах по 3 - 6 иммунизирующих дозв пересчете на группоспецифический Вполисахарид. Вакцина должна полностьюрастворяться при добавленйи (0,85+0,01) 5 ного стерильного раствора хлорида натрияв течение 1+0,5 мин. Раствор должен представлять бесцветную жидкость, опалесцирующую, но без видимых включений иосадка. Остаточная влажность готового продукта не более 2,5;. Одна иммунизирую щая доза содержит 85 - 105 мкг белка и50-55 мкг сиаловых кислот, Отношение вготовой вакцйне белок/полисахарид (1:0,6)(1:0,7). Вакцина должна быть стерильной, нетоксйчной при испытании ее в тестах намышах и морских свинках, апирогенной привнутривенном введении кроликам, Вакцинадолжна быть иммуногенной для мышей ивызывать нарастание в сыворотках иммунизированных мышей титров специфическихВ-антител,выявляемых в РПГА,В табл. 1 приведены основные характеристики менингококковой В-вакцины,Как видно из табл. 1, попучейНая попредлагаемому способу вакцина индуцирует образование антикапсупьных. антител всыворотках мышей при однократной иммунизации в отсутствии адьюванта, что не достигалось при использовании способапротоипа.Полученная по предлагаемому способувакцина проверена на людях. Под наблюде ниемнаходилось 82 человека в возрасте19-22 г., из которых 56 были вакцинированыподкожно однократно и 43 двукратно, Лица,входившие в контрольную группу, получалиинъекции фйзиопогическогораствора.Кровь йз локтевой вены брали до иммунизации, через 10-24 и 54 дня после первойиньекции и спустя 30 дней после 2-ой инъекции препаратов, т.е. на 85-ый день послепервой инъекции, Сыворотки отсасывали иисспедовалй в реакции. пассивной гемагглюти нации (РП ГА), используя в качестве диагностикума эритроциты человека с группойкрови -(О), сенсибипизированные высокоочищенным капсульным"пописахйрйдом менингококков группы В,Как видно из табл; 2, двукратная инъекция разработанной вакцины с интервалом в54 дня обеспечивала интенсивную индукцию антикапсульных антител, При этом 4- кратное нарастание титра антител отмечено у 62,8+7,5 ф лиц, получивших 2 инъекции 5 вакцины. Естественное противоэпидимичивание обеспечивало аналогичный эффект лишь у существенно меньшего количества 20,8+8,5% лиц в контрольной группе (р0,05),10 П р и м е р 2, Обоснование выбора фазы роста культуры менингококка,Получение культуры в экспоненциальной фазе роста позволяет сохранять антигены в высокомолекулярном состоянии, Это показано в следующих опытах, представленных в табл. 3.Опыт 1. Культивирование менингококка штамма Ь 125 серогруппы В осуществляли в ферментере экспоненциальным отливнодоливным способом, указанным выше в примере 1, различие состоит в том, что использовали модифицированную попусинтетическую питательную среду Коэн-Виллер. В,ИМолекулярную массу пописахаридов определяли методом гельфильтрации на Сефарозе 4 В, При анализе профиля элюции этого препарата оказалось, что выход полисахарида до Кб=-0,25 составил 610.Опыт 2. Штамм; питательная среда, метод выделения антйгена и др, полностью соответствуют опыту 1, Отличие состоит в35 том, что процесс культивирования менингококка вели до начала стационарной фазыроста, Все это повлияло на выход высокомолекулярного полисахарида (до Кд= 0-25). Онсоставил - 460 . Опыт 3, Он аналогичен опыту 1, отличие 40 в том, что выращивание менингококка осуществляли до поздней стационарной фазы роста. Выход В-полисахарида до КО=0,25 составил - 25,45 Таким образом видно, чтопо мере роста культуры количество высокомолекулярного компонента в препаратах В-полисахарида снижалось, что обосновывает целесообразность попучения культуры в экспоненциальной фазе роста; поскольку высокомолекупярный полисахарид более иммуногенен П р и м е р 3. Обоснование использования синтетической питательной среды,Выращивание менингококка осуществляли в двух средах: синтетической и попусинтетической - Коэн-Виллер способом, указанным в примере 1. Способ выделения пописахаридно-белкового комплекса также аналогичен способу, укаэанному в примере Из выращенных культур выделяли группос 25 пецйфический полисахарид по методу ОотзспИсп С.Е, (5) в модификации Кувакиной1. Сравнительный анализ выхода комплекса показал преимущества использования синтетической питательной среды.В табл. 4 приведены данные, свидетельствующие о преимуществах использования синтетической среды при получении полуфабриката вакцины.П р и м е р 4. Определение оптимальной концентрации цетавлона.Штамм, питательная среда, выращива.ние менингококка, сбор культуры аналогичны примеру 1; Для определения . оптимальной концентрации цетавлона; добавляемогов культуру, использовали следующие растворы цетавлона - 0,01%-ный, 0,05%-ный, 0,10%-ный, 0,15%-ный, 0,50%- ный.В табл. 5 приведены данные по обработке культуры разным количеством цетавлона; свидетельствующие о том, что 0,10 й 0,05% является минимальной концентрацией цетавлона, обеспечивающей гибель менингококков и формирование осадка в течение 2.П р и м е р 5, Определение оптимальных условий обработки этанолом для выделения полисахаридно-белкового комплекса,Штамм, питательная среда, способ культивирования менингококка, получение цетавлонового осадка, выделение из него экстракта аналогичны примеру 1. Для определения оптимальных условий обработки этанолом полученных экстрактов использовали различные концентрации при однократной и двукратной обработке.В табл. 6 приведены результаты определения условий обработкй этанолом, из которых следует (опыт 4), что предварительная обработка экстракта(20.5)% этанолом с последующим удалением осадка значительно повышает растворимость препарата, и -при этом не происходит потеря сиаловой кислоты (капсульного полисахарида).Таким образом, предлагаемый способ обладает новизной, заключающейся в использовании для получения биомассы управляемого отливно-доливного экспоненциального способа культивирования менингококка в синтетической питательной среде, Существенные отличия заключаются в использовании для обработки цетавлоном цельной культуры, минимальных концейтраций цетавлона (0,10+0,05%) и предварительном удалении из солевых полисахаридно-белковых экстрактов фракций, осаждаемых 25% этанолом.Положительный эффект состоит в значительном упрощении способа получения противоменингококковой вакцины (табл. 7), 45 которая в отличие от прототипа индуцируетсинтез антикапсульных антител у животныхв отсутствии адьюванта. Предложенныйспособ позволил получить препарат, у кото 5 рого, в отличие от ранее предлагавшихсяпрепаратов, достоверно зарегистрированаспособность к индукции антикапсульныхантйтел у человека без применения ионовметалла.10 ф о р м у л а и з о б р е т е н ияСпособ получения полисахаридно-бел.ковой вакцины против йеззег 1 ареппцЮбз серогруппы В, включающийкультивирование штамма в условиях аэра 15 ции в жидкой синтетической питательнойсреде, содержащей -цистеин гидрохлорид,глюкозу, хлористый аммоний и дистиллированную воду, сбор культуры, добавление цетавлона, отделение осадка, экстракцию20 полисахаридно-белкового комплекса хлористым кальцием, многократную обработкуэкстракта 96%-ным этиловым спиртом с последующим отделейией полученного комплекса центрифугйраванием, стерилизацией25 и лиофилизацией целевого продукта, о т л и.ч а ю щ й й с я тем, что, с целью упрощенияспособа и повышения активности вакцины,культивироваййе проводят экспоненциаль-ным отливно-доливным методомв жидкой30 питательной среде, дбполнительно содержащей 1.-глутамат натрия, хлористый калий,хлористый натрий, сернокислый магний се.миводный, фосфорнокислый двузамещенный натрйй двенадцативодный и цитрат35 натрия трехзамещеййый при следующемсодержании компойентОв, г/л:1:глутамат натрия1,2 - 1,4:цистеин гидрахлорид 0,02-0,0440 Хлористый калий 0,09-0,1Хлористый натрий 5 - 7Сернокислый магнийсемиводный -0,05-0,07Хлористый аммоний 1,24-1,26Фосфорнокислыйдвузамещенныйнатрий двенадцативодный 2,3 - 2.7Цитрат натрия трех 50 . замещенный 0,4 - 0,6Глюкоза 1,4 - 1,8Дистиллированнаявода До 1 лцетавлон добавляют до конечной концент 55 рации 0,05 - 0,15 об.%, обработку экстрактаспиртом осуществляют последовательнопри объемном соотношении экстракта испирта 1:0,2 - .1:0,3 соответственно, а затем- при объемном соотношении 1:0,75 - 1:0,85соответственно в течение 16-20 ч,ь ь е .+ Миьнимальнаья активная концен эриьтроцитов в реакции пассивное блицдедеь еееесего с а-анием по оскоднын. РОГА к капсульнону поли трцду И,аалтодебй 1 Е ГруППН В у ЛЮищ ее ещеиивЕеее ьвеь еае" етие леденипо титраме титров антител вивеМишеа е ь ЪОбследоааннал г Динами еа ае,а ееивееФроим исследоеапнп по отнопанно к еак цннацнн ее иаие ы еекратнин нарас тнопенно к ие иваВсего обследовало а и аи У ьи а е еае60 1 ь 320 1:600 :1200анне 11 В щееещеавве иващв тпь ее а щЮв а в айа тыаее аи вщйй сконтро сраеневнр Череп 1 О днедцапа 2 е днлцереэ 54 днп1 до 2 нньекции)царап В 5 днад(череп 39 днадпосле 2 интенции)аев веи ае е ееавивиф Статистическианачнноа ция достьаточнаеяь Для сенсибилизациимагглютинации. 034,09. 6,623,1+ 0,462,В.И,520,01 В,5шива та а Ье 13 . 32 . б"0 ь 1 ВВ 11 3 1 б1. 131 В б . 22059 5: 25е ье еь еа ае еа авиа ееещещие веешщЧейвеееаейийвпаи прн р (0,0011750689 Таблиц 3 Таблиц лекса специфичесбраны й. вепйдЮдвании в ферментереазличных жидких и Сравнительный выход природного комп кого полисахарида и белков наружной мем. серогруппы 8 штамма Ь 125 при вйращи до конца экспоненциальной фазы роста в р тательных средах.а Т ределение оптимальнОй концентрации цетавлонаВлияние фазы роста культуры й, реппдЮдз серогруппы В на выход высокомолекулярного полисахарида1750689 16 15 Таблица 6 Определение оптимальных условий обработки зтаноломТабли ц,белкового Сравнение спосо комплекса мен получения полиса гококка серогрупп Способ 1Мотеле С, 19 Способ 2предлагаемый тадия Ста Ъв125 (тип 2 В)интетическая С И 769 (2 а) 7622 (тип 6)Содержит природное сырье тамм 2 итательная ПроцессвированФаза рос еуправляемый культи"и льтае цетавопределенна Культуральный супернатант 1 ь-ный цетавлон; 0,5 ч 3 объема, 1 ч; 0 С 0,75 объе- м Осажден ономбработ этан 0,25 объема, ) ч0,80 объема, 18 чНет 6 вк дго льф и ет Гельфнльтрачерез СефароСЬ 2 В ст оксихолатаго (вес/объем Добавление дезнатрия О,"нодо рН 8"9К раствору содержа1 О мкг комплекса д0,01 М Фосфат натр7,4 и 0,0001 М А 1Нет Подготовка к стерилизации ет влениета вных усщемуобавляетия до рН2(ОО) антикпх антител тствии нта;. оставитель В.Романова хред М,Моргентал Корректор В,Гирняк Тираж Подписноетвенного комитета по изобретениям и открыт 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 ГКНТ ССС мбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гага изводственно-издательский 10 1 О При гопрела стерн ловня 11 Синтесульн в отс Редактор М.ТовтиЗаказ 2639ВНИИПИ Госу Растворениеаммония, содмертиолат,звуком " 10ванне при 2 в 0,11 М ацетатеержащем 0,013-ныйбработка ультрамий. Центрифугиро"00-20 мин Управляемыи экспоненциный отливно-"доливнойЭкспоненциальная Цельная культура 0,1