Способ получения пептидов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 191 (1 94 7 ОБРЕТЕ АТЕНТУ аг, Современн в органическо 1968.св 413 а ИЯ ПЕПТИДОВ асается пептидов ния пептидов общ особуологиин, 111 - .н, РЬе - Ь-ф енилизопроп -пролин, Д 1-из которы илго -едицине,об полу ег - Ь-серии, 1.-тирозин,чен обл токсичных, ертензивелей для хрослое силикагеля Системы раствоматографии в тонк(по объему): К(1 - метан хлороФорм 1:1водя - н-бута(3 од 4 ОСУДАРСТВЕНКЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯРИ ГКНТ СССР(71) Дзе Юниверсити оф Май(72) Джеймс Вальтер Райани Альфрэд Чанг (1 Б)(57) Изобретение кв частности получе Изобретение относится к получения пептидов - новых чески активных соединений, могут найти применение в мЦель изобретения - спос ия новых пептидов, мало адающих высокой антигип ной активностью, более устойчивых хп ч 11 го.к гидролизу.Используются следующие сокращения: АСЕ .- ангиотензинконвертирую щий фермент, А 1 а - Ь-аланин, Агав Ь аргинин, Азр - Ь-аспарагиновая кис лота, Боктрет-бутилоксикарбонил, Бпок - 2-(4-бифенил)-2-пропилоксикарбонил, Бз - бензоил, Кбо - бензил оксикарбонил, Ддок - 1".Ь,Ь-диметил,5 диметнлоксикарбонил, Гли гли 5 С 07 К 5/08//А 6 ф-лы К-(А) Б-СН, -СНК -С(0)-Кгде К. - бензоил, циклопентакарбонил,ацетил, пропаноил, бутаноил или водород, А = Ь- и В-фенилаланил,В-аланин, В-триптофан, В-лейцин;К = СН , К = Ь-пролил, обладающихантигипертензивной активностью, чтоможет быть использовано в медицине,Цель - создание новых активных и ус-.тойчивых к гидролизу (1 п ч 1 гТо) пептидов, Синтез ведут реакцией соединения Н-(А) -Б-СН -СНК-С(0) -К, сК-галогенидом при указанных значениях А, К, К и К . Новые лептидыв сравнении с каптоприлом активныпри концентрации в 2,5 раза меньшейи отличаются более длительнымдействием, 4 табл. церин, Нда - Ь-гисти лейцин, Ьеи - .-лейц нилаланин, Фпок - 2-ф оксикарбонил, Ртов Ь,4-дегидропролин, Тгр - Ь-триптофан, Т Ча 1 - Ь-валин) ф уксусная кислота фн-бутанол 26:24-;15 ) - нбутанол - пириднн уксусная кислота - вода,15:10:3:12;11 (5) - н-б тапол - уксусная киспота - этилацетат - вода1:1:1:.1;К (6)хлсроформ - метанолуксусная кислота 2. "1:0,003;К 1 (7)н-бутан ч - уксусная кислота - вода 4;1:1;К (8) - этилацетат - уксуснаякислота 38:2.51 М 1-спектры получены при 60 МГц1 значения - концентрация сю50/-ной инпии.ующей активностью поотношению к превращающему ангиотенсин фермеьЕту,Систем испытания: 1 мл инкубируемой смеси, содержащей 0,6 мл боратного буфера, 0,2 мл 17,5 ммольбензоил-И.у-Н 1 з-Ьец в боратном буфере, соединения в боратном буфере ирастир фермента, инкубирование при37"С н течение 60 минБоратный буфер: 0,1 М раствор борной кислоты, содержащий 0,8 М ИаС 1и 0,1 М 11 аСОз, содержащий 0,8 МНаС 1, смешивают и доводят до рН 8,3ЛСЕ - порошок легкого кролика в ацетоне, Определения: УФ-поглощение при228 нм после экстрагирования бензоил-С 1 у-этилацетатом,П р и м е р, Я - 3-(Н-трет-бутилоксикарбонил-Ь-фенилаланилтио)-2-Р-метилпропаноилЗ-Ь-пролин,К раствору 2,65 г Вос-Ь-РЬе во20 мл ТГФ при -20 С добавляют 1,95 гБ,Б-карбонилдинмидазола (КДИ) в20 мл ТГФ и результирующий раствороперемешивают при -10 С в течение 1.ч,Затем добавляют 2,17 г ЕЕ-(меркапто-2-Р-метилпропаноил) Ь-пролина при20 С и перемешивают 10 мин при тойже температуре и еще 50 мин перемешивают при комнатной температуре, Растворитепь отгоняют при пониженномдавлении при 30 С и к остатку добаволяют 200 мл АсОЕ и 50 мл воды. Смесьдоводят до рН 1,5 добавлением 2 нраствора НС 1 при перемешивании иохлаждении на ледяной ванне,Органический слой дважды промыва"ют насыщенным раствором ИаС 1 и оргаи ческий растворитель отгоняют нацентробежном испарителе после осушения над безводным МАЗО.1)саток очищают с помошью хОма"фтуг 1 адии в колонке на БЕО (2 см хх .) см), что дает 4,49 г (9.)с11 3-(1 трет"бутипоксикарб эпил-Ь 40 45 50 55 5 О 5 20 25 30 35-фенилаланилтио)2-Рметилиропаноил "Ь-пролина, К (1) 0,6; К (2) 0,76, 0,82; К (3) 0,68, 0,72; аминокислотный анализ: рН 1,00, Рго 1,00.К раствору 1,0 г указанного соединения в 2,1 мл анизола при перемешивании и охлаждении на ледяной ванне добавляют 1,61 мл трифторуксусной кислоты (ТФУК) и перемешиваютч при комнатной температуре. Раствори- тель отгоняют при пониженном давлении и 30 С, к остатку добавляют эфироный раствор НС 1 и результирующий осадок несколько раз промывают диэти ловым эфиром.К суспензии указанного осадка в 15 мл АсОЕТ при перемешивании и охлаждении на ледяной ванне добавляют 0,793 мл И-этилморфолина и 0,243 мл бензоилхлорида, Реакционную смесь перемешивают 1 ч при комнатной тем пературеПосле добавления 2 мл воды к смеси ее рН доводят до 1,0 добавлением 2 .н раствора НС 1 при пере мешивании и охлаждении на ледяной ванне.Органический слой дважды промывают насыщенным раствором БаС 1, а органический растворитель отгоняют на центробежном испарителе после осушения над безводным М 8804 .Остаток очищают хроматографией в колонке на ЯО. (2 см х 33 см), что дает 800 мг (81,0 Е) продукта в виде масла. В указанных условиях получаютследующие соединенияБ -3-(ЕЕ ъ-бензоилЬ-фенилаланиптио)-2-Р-метилпропаноил 1-Ь-пролин;моле м 468 р )э = 1168К (1) 0,52; К (2) 0,7; К,(3)0,56; К (4) 0,61; К(5) 0,75;К(6) 0,56; К (7) 0,74,51 МР Р (СРС 1 э + СРзОР): 1,191609455 Всего:2,1 мл 3 7 С О, ЗО, 60,120, 180 мин100 мкл инкубационной смесиметанол 200 иклвстряхивание и центрифугированне10 л надосадочной жидкости жХ 11 Д-П-метилпропаноил-Ь-пролин:ОД=оС ОС29,5 ; В (6) 0,55; В. (7) 0,59М - 3-(И -ацетил-валилтио)-2-0-метилпропаноилД-Ь пролин: ЫД = 1073,8Проведены биологические испытанияСоединений, полученных в условияхпредлагаемого способа.Проведены предварительные испытания на крысах, сравнивающие противогипертонические характеристики каптоприла и четырех соединений по изобретению,В табл,1 показан средний процент, (Х) ингибирования индуцированного повьппенного давления, вызванного введением 0,4 ммоль/кг каждого из указанных соединений,25 Из приведенных данных видно, что несмотря на колебания эффективности в зависимости от времени и конкретного использования предлагаемого соединения проявляются эффекты, которые сопоставимы с эффектом каптоприла при выбранном уровне дозировки. Причем столь высокие уровни дозировки каптоприла сопровождаются сравнитель но высокой частотой появления неже" 35 лательных побочных эффектов у чело,века - это обусловливает много меньший уровень дозировки при реальном кпиническом лечении людей,Предлагаемые соединения существен-,40 но более стабильны, чем каптоприл. как в биологических средах, так и в прочих условиях, Это доказывается их стойкостью к немедленному гидролизунф к,БИФМС.0154 М фосфатньй буфер (рН 72,5 Ж 105,ОООх я надосадочная10 мМ целевое соединение в условиях сильно гидролитической среды и сравнительно длительной со храняемостью, Представленные данные п чсго демонстрируют характерную стабильность многих из этих соедине ний в условиях разлагающихся сред плазменных и тканевых гомогенатов (табл, 2).Использованные методики гидролиза 1 п чСго.А. Инкубационная смесь: 1 мл 10 Е-, ного гомогената печени крыс (0,1 М калий-фосфатный буфер, рН 7,4) + 1 мп испытуемого соединения 2 х 10 М в том же . фосфатном буферном растворе, Метод анализа: 100 мкл отбирают из инкубационной смеси, депротеинизиру" ют добавлением 200 мкл этанола и центрифугируют, На жидкостную хроматографию высокого давления направляют 20 мкл надосадочной жидкости,В, Инкубационная смесь: 1 мл 5 Е- ного гомогената печени. крыс (0,1 М калий-фосфатный буфер, рН 7,4) + 1 мл испытуемого соединения 2 х О М в гом же фосфатном буферном раствореМетод анализа: 100 мкл отбирают из инкубационной смеси, затем добавляют шесть капель, 1,0 н НС 1 и 5 мл этилацетата После механического перемешивания в течение 10 мин и центрифугирования в течение 1 О мин упаривают отобранный этилацетатный слойОстаток растворяют с помощью 1 мл воды, затем добавляют 0,5 мл 0,4 М фосфатного буфера (рН 6,85) и 5 мкл 5 х х 10 М БИФМ и оставляют стоять в-3течение 40 мин при 0 С. Измерение проводят на линии возбуждения 310 нм и линии испускания 365 нм (предел: 0,14 г каптоприла).БИФМ: 11-и-(2 бензимидазои фенил 1-малеимидх зВОв-Я Я-фЯФлюоресценция6094Условия ЖХВД: колонка "Бондапак С 18", смесв растворителей СН СБ 0,17 гидроокись тетраметиламмония детектор; 220 нм, расход 1 мл/мин.0Инкубационная смесь: 1 мл кры синай плазмы (0,1 М калий-фосфатный буфер, рН 7,4) + 1 мл раствора испытуемого соединения (400 мкг/мл того же буфера). Метод анализа: 100 мкл отбирают иэ реакционной смеси, затем депротеинизируют добавлением 200 мкл ЕВОН и центрифугируют, 20 л надосадочной жидкости направляют на ЖХВД,.Е. Инкубационная смесь: 1 мл 20 Е- ного гомогената кишечника крыс (0,1 М калий-фосфатный буфер рН 7,4) + 1 мл раствора испытуемого соединения (400 г/мл того же буфера)Метод анализа: 100 мкл отбирают из реак ционной смеси, затем депротеинизируют добавлением 200 мкл ЕОН и цент" рифугируют, 20 мкл надосадочной жидкости направляют на ЖХВДР. Инкубационная смесь: 1 мл 203- 25 ного гомогената крысиной печени (0,1 М калий-фосфатный буфер, рН 7,4) + 1 мл раствора испытуемого соединения (400 г/мл того же буфера). Метод анализа: 100 мкл отбирают из 30 реакционной, смеси, затем депротеинизируют добавлением 200 мкл ЕВОН и центрифугируют, 20 мкл надосадочной жидкости направляют на ЖХВДХарактерная стабильность этих соединений подтверждается данными хп35 что, демонстрирующими, что в большинстве случаев существенный процент исходного соединения остается в кровотоке в течение мноГих минут после введения крысам.Внутривенное введение. Двум крысам расы 5 Р делают внутривенную инъекцию 36 мг М-(11 бензоил-Ь-фенилаланилтио)-2-Э-метилпропаноил 1-Ь-про 45 лина (В Ь-РЬ ЯО) и Ь- З- (И-бензоил-Э-фенилаланилтио)-2 0-метилпро паноил 1-Ь-пролина (Вг-Ь- РЬе-ЯЯ) в 0,5 мл О,1 М БаНСО, Крысы имеют массу каждая 360 г и голодают в те чение 21 ч до инъекции, Концентра-ции в плазме введенных инъекций соединений и их гидролитов, бензоил- Э фенилаланина (Вг-РЬе) и бензоил.-фенилаланина (Вг-Ь- РЬе) измеряют55 с помощью жидкостной хроматографии (табл. 3)Оральное введейие. 100 мг Б 3-(бензоил-Ь-фецилаланилтио)-2 55 10-0-метилпропаноил -Ь-пролина на килограмм массы тела вводят орально крысам массой 350 г, голодавшим в течение ночи, Испытательный раствор содержит 20 мг И-(бензоил-Ь-фенилаланилтио) 2 Р-метилпропаноил 1 -1 пролина в 1 Е-ном водном растворе гуммиарабика Пробы отбирают периодически с помощью интактного кровообращения в энтерогелатической системе, Концентрации М3-(бензоил-Ь-Фенилаланилтио)-2-Р-метилпропаноил 1-Ь-пролина и его гидролита, бензоил-Ь-фенилаланина в плазме из воротной вены и в токе желчи измеряют с помощью жидкостной хроматографии (табл.4),В указанных условиях каптоприлбыстро разлагается до своего дисульфида и других метаболитов, которыенеактивны как ингибиторы. По прошествии 66 мин инкубирования с плазмойкрыс, человека, обезьяны и собак количество,неизменного Я-каптоприласоставляет соответственно 0,7, 10 и253, основной продукт дисульфид,Надосадочная фракция 9000 х 8 гомогената печени, почек и кишечникакрыспочти полностью переводит каптоприл в его дисульфид и другие продукты в течение 120 мин.По крайней мере, одно из соединений по изобретению Б-(И-циклопентилкарбонил-П-аланилтио)-2-0-метилпропаноил-Ь пролин (срс Р-аЬа-ЯЯ)демонстрирует не снижающуюся эффективность на протяжении 90-180 минпосле орального введения (табл. 1).Каптоприл достигает пиковой эффективности к 90 мин, а затем она.падает,По прошествии 180 мин И-З-(М.циклопентилкарбонил-П аланилтио)-2-П-метил-Ь пролин более эффективный ингибитор без каких-либо признаков ослабления его реакций,Хотя ни одно из указанных соединений еще не испытывалось на людях,подобное испытание проведено на соединении, близком аналоге, И 13-.(гг.-метилпропаноил-Ь-пролица (с 1 с - аЬ. 2- Р) метилпропацоил-Ьпролина,Это соединение идентпчцо И-(М-циклопентилкарбонцл "0-алннилтио)-2-метилпропацоил.-прелццовому соединению, с исключецццл, что в концевом кольце присутсгвует дополнительная -СН-группа,.4 7 11 12 7 31 31 34 Сравнительные исследования на здо" ровых людях показали, что действие 40 мг (0,096 ммоль) Б-(Б-циклогексилкарбонил-аланилтио) 2-О-ме тилпропаноил-Ь-пролина продолжается дольше, чем действие 100 мг (0,46 ммоля) каптоприлаПолученные результаты подтвержда ют большую продолжительность дейстВия сложнотиоэфирных соединений каптоприла с ациламинокислотами по сравнению с самим каптоприлом. Кроме тоГо, эти соединения более удобны в обращении, чем каптоприл, благодаря своей более высокой химической стабильности, Срок хранения каптоприла необычно короток, его период полу" распада в водных растворах составляет приблизительно 30 мин. Сухой порошок также разлагается более, чемо на 50%, спустя три недели при 85 С.Соединения по изобретению, не имея свободной меркаптогруппы, огранически более стабильны, Растворы этих соединений могут храниться более длительное время, Например, 1 мг/мл 11-13-(Б-бензоил-Ь фенилаланилтио)-2 П-метилпропаноил )-Ь про. лина в 1;1 метанол/водном растворителе не дают никаких признаков раз" ложения по проишествии шести часов храненияКроме того, соединения по изобретению не требуется смешивать Испытуемое соединение ааааа аа аааа аааааа аа аз а а аа аа ааа ааааа аа ааааа эс восстановителем в порошковом виде, чтобы избежать протекания реакций ди меризации, которым подвержен каптоприл. Таким образом, соединения, полученные в условиях предлагаемого способа, активны, малотоксичны и более устойчивы при хранении, чем капаа топрил. 10 Формула изобретения Способ получения пептидов формулыггОВ-(Л-Я-СН 2-СН-С - В 2Вгде К - бензоил, циклопентакарбонил,ацетил, пропаноил, бутаноил,водород;А - Ь и 0 - РЬе, Р - АТа, П "Тгр, 0 вЬец;СНК = Ь-пролил,о т л и ч а,ю щ и й с я тем, чтоосуществляют взаимодействие соединения формулыН-(А 1 - Б - СН -СН - С30гр 21 с К-галогенидом, значения А, К, К, К имеют указанные значения. нгибирование индуцированногоовышенного давления, %, за врем 0 20 30 60 90 120 14 28 35 41 36 31 26 12 23 46 56 58 48 373Хабз 1 ица етодикач гччЗУ -2-1)-ь 28ч 60 28 А лпн,4 93,5 92,1 82,4 блипа 3 Стабиль вв еленин пытуемое со 5 35 1 3 (Венвоил, феитио)-2 0 ииетнл-прон1. пронинВх,-РеВ 3-(Бетио)-2 а апуоилЗ 98 33 57 96 43 119 8 423 241436 9оалагоил"лэа наоилф 1 л.фении+метил прона 227 17 135 117 57 76 85 1 Оа 22 3 1 1 92 ЗЗ 15 3 оли РЬе 20 (ч) Вв Испытуеое соеципепи Б- . н зоил-И-ало пцлтио етнл проа поил -1"про- Ч-Аце ти"-0-Фени ялани -0" ме тплпропа ион 1 -1,линИ" 3-(И-Бензоил-Фенилалаиилтио) 2-)-ииилпоппои 1- -Е-пролииВ-(И-Бензоил-Фенилаланилтио)-2-0-метилпропаноил - Е-пролинИ-И-Ьенэоил-лейцилтпо) -2-0-метилпропаноил 1-1,-нро" линЫ-(М-Пропанонл-триптофилтио)-2-0-метилпропаноил 1.-пролинМ-(И-Бутилоксикарбонил- -0-аланилтио) 2-0-метилпропаноил -Е-пролин Н-(И-Ацетил"лейцилтио)-2-0-метилпропвноил- -Е-пролинБ-(0-Аланилтио"0-метил-пропаноил)-1.-1 ролин И(И-Ацетил-изогейцилтио ) -2-0"ме тил-пропаноил.-пролин Время и 1 кубирзвани 1, Рин 10 30 60 80 120 180 ччичичъ ччачвчичч ичпчичю60 1899 98 97 105,1 99,6 97,0 92,сть соединений по нвобретенно в гидролизу при внутривеннопри времени мии609455 Таблица 4 оединений к гидро- ведении, мени, мин Отборпроб и Испытуемое соедине Стабильнос изу при о оль/мл, и ном в вре 0120 15 М-(Бензоил-Ь-фенилаланилтио)-2-Э-метилпропаноил -Ь-пролинР 1-13-(Вензоил-Ь-фенилаланилтио)-2-П-метилпропаноил -1. пролинБензоил-Ь-фенилаланин Воротная 0,025 0,246 0,010 0,312 0,002 0,054 вен 0,49 0,30 0,677 0,786,102 ,164 Составитель В,ВолковаРедактор И.Шулла Техред М.Ходанич Корректор В,Гирняк Подписное ираж 317комитета1 осква,Заказ 3627ВНИИПИ Государственног113035 о изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР35, Раушская наб., д. 4/5 оизводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина, 101