Способ получения пептидов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК НЦ 1531858 1) 4 С 07 К 7/00 // 7 02 0 НИЕ ИЗО ТЕНИ К ПАТЕНЯф 47Компа ни (Ю )ДимарчиБрук (118)088.8)бке К. Пептиды. олидон(Я(ДЧфА),ем наибо пи ми пр яв тенмущих Изоб твован ов, им яется Реакц сть,ный и вательн ки акти рый мож мии и бЦель лабокислых условия е проводят в спользование т на слоты. турком сусной в темп оцесс проводятрвале 25-50 С. Выбор темпера сал висит реакции т стабильност ы птида и при системе Н-Х Рльной явля-Х-Рго-и- го етьеи кислоты протонного Ф и апротонн ть; И-мтся пептид, Предпочтит максимально высока ра,ер тилгужи ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Зли Лилли энд(72) Ричард Денниси Джеральд Стефен(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ(57) Изобретение касается полученияпептидов, имеющих аминокислотную последовательность, определяющую биологически активный пептид или протеин.Цель изобретения - создание универсального способа. Последний включаетрасщепление пептида формулы Н-Х-РгОпептид, где Х-Мег., 1,еи, Бег, Азр,относится к усовершенособу получения пептиминокислотную последопределяющую биологичесптид или протеин, кото- и применение в биохиотехнологии.изобретения - создание униого способа получения пептидов.Обработку соедине тид проводят в среде растворителя. Пример растворителей могут 2Йе, пептид - последовательность аминокислот телячьего панкреатического полипептида, фактора секреции гормона роста, А(80)-инсулин-А-цепь сульфонат, В(80 ) -инсулин-В-цепь сульфонат или проинсулин, Процесс расщепления ведут в слабокислой среде при 25-50 С и концентрации кислоты, например уксусной, 0,25-0,5 моль в апротонном растворителе - И-метилпирролидоне, диметилсульфоксиде, И,И-диметилформамиде, с образованием и расщеплением в момент образования дикетопипера инового производного с получением пептида и дикетопиперазинового Н-Х-Гго-остатка. Эти условия позволяют расщеплять белок или пептид, имеющий остаток пролина, и осуществлению этого процесса не меша ет присутствие в пептидной цепи метионина, лизина. 2 з.п, ф-лы, 12 табл.1 О 55 ческце растнорители ответствующая стабильности и природе третьего амицокислотного остатка,Реакцию расщепления периодически контролируют, следя за ходом образования дикетопиперазина, При необхо 5 димости реакцию прерывают и получаемый в результате расщепления продукт выделяют из реакционной смеси с использованием известных методов.Выбранные пептиды, используемые н качестве моделей для предлагаемого способа, получают методами твердофазного синтеза, Их чистоту подтверждают методом жидкостной хроматографии высокого разрешения, Перед расщеплением такие пептиды хранят в ниде аморфных лиофцлизиронанцых твердых веществ. Число экспериментальных параметров изменяют (показано их вли 20 яние нд реакцию расщепления).Ниже приведены оптимизированные условия с использованием органической и водной сред соответственно и их примецение ца пептиде Мег-Рго-С 1 у-С 1 УП 1, где ИН обозначает присутствие ацидного Фрагмента на С-окончании пептида.Условия органического расщепления.10 мг Мег-Рго-С 1 у-С 1 у-Ю растворяют в 1 мл ИМП, который обезвожинают хранением в течение недели надо молекулярньпчи ситами размером 4 А.оСмесь выдерживают при 25 С при постоянном перемешивании и реакцию инициируют добавлением 0,33 М ледяной уксусной кислоты (НОАС). За ходом расщепления следят по образованию метиониц-пролин-дикетопиперазина и исчезновению исходного пептида, анализируя эти величины методом обратимофазной хроматографии. Хромдтографическое определение проводят с использованием колонки размером 0,46 х х 25 см с 111 Егозреге С, н 0,1 Х-цой трифторуксусцой кислоте (ТфК), приме 45 няя н качестне элюента ацетонитрильный градиент, Во время каждого днализа реакцию останавливают путем десятикратного разбавления 0,1 Х-ным раствором ТФК, Дикетопиперазиновый пик собирают и его идентичность подтверждают дминокислотным и масс-спектральньм анализом.В табл, 1 представлены данные по уровню образования дикетопиперазина при раз вицын концентрациях кислоты в условиях расщепления, проводимого при 25"С н среде 1 фА, Регистрируют заметцчю скорость реакции и устдцавливают, что она зависит от концентрации слабой кислоты. При проведении аналогичной обработки н средеДМСО установлено уменьшение скоростирасщепления.Как показано н табл. 2, увеличение температуры расщепления до 40 Сн среде ДМСО приводит к повышениюскорости реакции до значений, сравнимых с теми, что достигаются в средеДМфА при 25 С.Из табл. 1 следует, что оптимальная концентрация кислоты лежит в интервале 0,25 - 0,5 моль.В табл. 3 представлены результатыисследования влияния температуры насерии пептидов, в которых изменяюттолько боковую цепь третьего остатка.Повьппецное стерическое затруднениена этом участке замедляет скоростьреакции, Однако но всех случаях отмечается заметное расщепление.Г Важным фактором является выборапротонцого растворителя. В качестверастворителя должно быть выбрано вещество, которое промотирует, или покрайней мере не ицгибирует образование дикетопипердэина, что сопронождается расщеплением с образованиемжелаемого конечного продукта, и в тоже время оказывает минимальное деградирующее действие ца пептидныйпродукт,В табл. 4 приведены данные постабильности ряда протеинов и пептидов н условиях их органического расщепления, которую определяют методомобратимофазной жидкостной хроматографии высокого разрешения (НР 1,С),показано остающееся после воэдейстния ца выбранный протеин или пептидколичество определенной реакционнойсреды в течение указанного времении относительное преимущество ДМСО посравнению с ЛМфА.В табл. 5, аналогично табл, 4,представлены результаты по стабильности с использованием метиоцильного человеческого гормона роста.В табл. б представлены результаты исследования влияния ряда растворителей на расщепление Лег-Рго-С 1 у-С 1 у-%1.Как следует из представленнгпх данных, предпочтительными растворителями являются ИМПГ 1 фА и йСО, представляющие собой дпротоццые оргдни15 З 18В табл. 7 приведены результатыисследования влияния температурына ряд пептидов при использовании вкачестве растворителя ДИФА или ДМСО. 45 Из табл. 1-7 следует, что ДМФА посравнению с ДАССО оказывает большеевлияние на образование дикетопиперазина и сопровождающее его расщепление, однако, это соединение оказываетболее сильное деградирующее действиена протеиновый или пептидный продукт.Для достижения оптимальных результатов следует установить хороший баланс 15в выборе реакционных условий в отношении конкретного пептидного илипротеинового продукта.В табл. 8 представлены данные,полученные в результате примененияусловий органического расщепления намодельном пептиде, имитирующем предлагаемое соединение, в котором группа пептида представляет собой человеческий гормон роста, В последнемдве первые аминокислоты представляютсобой РЬе - Рго. Таким образом, возникает возможность образования дикетопиперазина из фрагмента Х-Ргопредлагаемого соединения и нахожденияследующей формы дикетопипераэина изинициирующего фрагмента РЬе - Рго,полученного в результате применениячеловеческого гормона роста,В табл. 8 приводится сравнениеМе 1 - Рго - РЬе - ТЬг - 11 е - МН с35РЬе - Рго - ТЬг - 11 е - МН . Лслученгные результаты свидетельствуют о медленном образовании дикетопипераэинаиз последнего вещества.40Таким образом, условия обработкипредлагаемого соединения МеС - Ргочеловеческий гормон роста могут бытьточно установлены с тем, чтобы мак симизировать первичное образованиедикетопиперазина и сопровождающееего расщепление при минимальном вторичном образовании дикетопипераэина.В этом отношении ММП представляетсобой наиболее желательный растворитель, поскольку в его присутствииуровень образования дикетопипераэиназначительно выше, чем в случае ДИСО,и близок к значениям, достигаемым вДМФА на поздних стадиях реакции. Учитывая повышенную стабильность гормона роста в ММЛ по сравнению с ДМФА(табл. 5), можно сделать вывод, чтопервое иэ указанных веществ является 58 6желательным растворителем по крайней мере для данного применения,Оптимальное водное расщепление МеС - Рго - С 1 у - С 1 у в ,МН достигается в результате растворения 1 мг пептида в 1 М натрий-фосфатном буфере при рН 8,0. С целью ускорения расщепления температуру в течение 24 ч подо,держивают равной 55 С. Степень расщепления определяют по предлагаемому способу для органического расщепления.Условия водного расщепления. Оптимальное водное расщепление Ме 1 - РгоС 1 у - С 1 у - МН достигается в результате растворения 1 мг пептида в 1 М натрий-фосфатном буфере при рН 8,0С целью ускорения расщепления температуру в течение 24 ч поддержиовают равной 55 С, Степень расщепления определяют по предлагаемому способу для органического расщепления.В табл. 9 приведены значения выхода расщепления при рН 7,0 с использованием в качестве субстрата пептида Ме - Рго - С 1 у - С 1 у - МНРеакцию проводят при трех различных температурах с использованием различных концентраций двух буферных солей. Лолученные результаты показывают, что фосфатный буфер является предпочтительным по сравнению с ацетатным, причем наилучшие результаты обеспечивает концентрация 1,0 М.В табл, 10 представлены результаты исследования влияния рН на образование метионин-пролин-дикетопиперазина из МеТ - Рго - С 1 у - С 1 у - МП при 40 С в буферной водной среде, В качестве буферной соли применяют фосфат натрия. Полученные результаты свидетельствуют о предпочтительности щелочных значений рН. Лоскольку такие нежелательные побочные реакции, как деамидирование и десульфурирование, ускоряются при повышенных значениях рН, предпочтительным является рН 8.В табл11 приведены результаты изучения влияния различных буфернык солей на степень расщепления МеС Рго - С 1 у - С 1 у - МН при рН 8,0 и 40 С, Лредпочтительным буфером является фосфат натрия.В табл. 12 представлены результаты исследования влияния температуры на образование метионин-пролин-дикетопиперазина из ряда пептидов, в ке10 М НОАС/ДЧФА1 М НОАС/ЛИФА0,1 М НОАС/,71 ФА001 М НОАС/ЛМФА1003 ДМф100 Х ТФК 40553481 84428631 2261330О торых изменяют только боковую цепь третьего остатка от И-окончания. Как и в случае исследования, результаты которого представлены в табл. 3, ясно, что усиление стерических затруднений на участке третьего остатка замедляет реакцию. Однако во всех случаяхкроме двух, наблюдается заметное расщепление. Повышение температуры от 40 до 55 С заметно увеличиовает скорость и степень расщепления всех четырех испытанных тетрапептидов. Анализ продуктов, полученных в результате расщепления образцов пептидов и протеинов, проводят мего- дами анионообменной и обратимофазной хроматографии высокого разрешения. Анионообменную хроматографию проводят на Мопо С 1 колонке с 0,05 М трис-буфера, рН 8,0, содержащего ЗОБ ацетонитрила. Элюирование проводят с применением линейного градиента хлористого натрия. Анализ методом обратимофазной хроматографии осуществляют на колонке с ЕогЬах Со, размер поро150 Л с использованием ацетонитрильного градиента в О, 1 М фосфате аммоония при 45 Г и рН 7,0. Предлагаемый способ позволяет расщеплять белок или пептид, имеющий остаток пролина, при этом его осуществлению не мешает присутствие в пептидной цепи метионина и лизина. Формула изобретенияСпособ получения пептидов, имеющихаминокислотную последовательность,определяющую биологически активный5пептид или протеин путем расщепленияприродных пептидов, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью созданияуниверсального способа, соединенияобщей формулы:Н-Х-Рго-пептид,где Х - МеТ, 1.ец, Бег, Азр, РЬе;пептид - последовательность аминокислот телячьего панкреатического полипептида, фактора секреции гормона роста, А(ЯОз)4-инсулин-А-цепь сульфонат,В(БО) -инсулин- В-цепь суль 20 фонат или проинсулин,подвергают расщеплению в слабокислыхусловиях при 25-50 С и концентрациикислоты 0,25 - 0,5 моль в апротонном растворителе с образованием и25 расщеплением в момент образованиядикетопиперазинового производного сполучением пептида и дикетопиперазинового Н-Х-Рго-остатка.2. Способ по п, 1, о т л и ч а ю 30 щ и й с я тем, что в качестве апротонного растворителя используютМ-метилпирролидон, диметилсульфоксид,Б,И-диметилформамид.3. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и Й с я тем что В качестве кислоты используют 0,33 М уксусную кислоту. Содержание компонента, 7., за время реакции, чоСодержание компонента, 3, при температуре, С Пептид 40 25 Время реакции, ч Х 2 Д 2 21 МРТОф г 27 Не определяют То же2 100 Не определяют То же17 10088 76 22 МРРО-МНг МРРС-ИНг 95 68 20 1 О МРСГ-МНг-МегМРТО-ИН -МегМРРО-Я 1 -МеггМРРС-%1 -Мегг Рго - 01 у - 01 у Рго - ТЬг - 01 у Рго - Рго - 01 у Рго - РЬе - С 1 у Таблица 4 Содержание компонента, 7, за время реакции, ч Протеин" 1 М НОАС/ДМСО, 40 С т 24 1 М НОАС/ДФАА, 40 С 2 в 2 24 48 ГлюкагонРРФ ФСРРА(БО ) 1004279100 МН(Ьец - Рго -) 62 97 37 94 106 69 86 30 70 97 86 кТелячий панкреатический полипептид РР (Мег - Рго -).СРР - Фактор секреции гормона роста (Иег - Рго - ), А(80)4 -инсулин А-цепь Б-сульАонат1,ец - Рго - .В(ЯО ) -инсулин-В-цепь Б-сульФонат3 йОтносительный процент остатка, определенный по отношению к необработанному внешнему контролю. Таблица 5 оСодержание компонента, 7, при 40 Сза время реакции, ч Реагент 24 78/78 фк91/10085/90 45/34 75/86 77/75 65/68 77/99 70/89 0,33 М НОАС/ЛМФА0,33 М НОАС/ЛАСО0,33 И НОАС/141 МР Определяют методом обратимойазной НРЬС.кОпределяют методом анионообменной НРЬС.Таблица 6Зависимость расходования Иег - Рго - С 1 у - С 1 у - ИНот образования Иег - Рго - дикетопиперазина оСодержание компонента, 7, при 25 С завремя реакции, ч Реагент 0 2 4 6 24 66 72 99 94 10597 114 100 1 М НОАС/СНС 1411 М НОАС/н-РгОН 9780116 99 96 71 56 1011048873 1 И НОАС/ИеОН1 М НОАС/СН С 1 1 М НОАС/ДФА 1 И НОАС/Щ 1 СО 100 Не оп- ределяют 100 100 100 100Количество оставшегося исходного вещества.13 1531858 4 Таблица 7 Образование метионин-пролин-дикетопиперазина в двух выбранных растворителях в присутствии1 М НОАС при 40 С. ПептидФ Содержание компонента, 7, за время реакции, ч АФФА ДИСО 1" 24 76 22 20 10 100889568 36351 100 100 11 38 43 65 12 23- С 1 у - ТЬеРго - Рпе С 1 у НН 2 2 С 1 у -1 Н й С 1 у - ИН, Рго Рго Рго Рго 25 Таблица 8 Содержание компонента, 7, при 40 С за время реакции, ч Реа гент Мес - Рго - РЬе - Рго - ТЬг - 11 е0,33 И НОАС/ИМР 170,33 М НОАС/ДАССО 40,33 М НОАС/ДМфА 14РЬе - Р го - ТЬ г - 11 е0,33 М НОАС/ИМР 70,33 М НОАС/ДЧСО 40,33 М НОАС/ЛИ(ьА 15 47 27 63 99 33 98 23 11 37 78 27 88 Таблица 9Влияние различных буферных систем и их концентрацийна образование метионин-пролин-дикетопипераэина иэМег - Рго - С 1 у - С 1 у - МН при рН 7,0 о Выход расщепления, У, при температуре, СО,1 М фосфата натрия 1,0 М фосфата натрия 0,1 И ацетата натрия 1,0 М ацетата натрия 100 100 55 86 ф Образование метионин-пролин"дикетопиперазина при 100 С измеряют черезо2 ч, образование этого продукта при 40 и 25 С - через 72 ч. МРСС-ИНИРТС-КНМРРС-ННМРРС-%1г с ИРСС МРТС МРРСМРГС -15 1531858 Таблица 10 Влияние значения рН на образование метионин-пролиндикетопипераэина в 1,0 И фосфата натрия при 40 С Выход метионин-пролин-дикетопиперазина, 3, за время, ч рН 48 24 72 31 18 80 86 лица 11 Влияние различных буферных солей на образование пролин-дикетопипераэина из Иег - Рго - С 1 у - С 1 у - ИН прирН 8,0 и 40 С Выход пролин-дикетопипераэин 7 эа время, ч ер 2 1,0 М фосфата натр 1,0 М фосфата натр 1,0 И сульфита нат а б л и ц а бразование метионин-пролин-дикетопиперазинари разных температурах в 1,0 И фосфатномбуфере при рН 8,0 тид Выход метионин-пролин-дикетопипераэина,7, при температуре, Со 0 Время реакци1 1" 48 2 24 96 26 МРСС - НН-Ме г МРТС - ИН -Ме 1 МРРС - ИН -Ие г ИРИС - МН-Мег- С 1 у - 1 Н С 1 у - ИН Рго - С 1 уРго - ТЬг Рго - Рго Рго - РЬе С 1 у 11 Н 2 ИРСС-НН,МРТС-М 1МР РСНМРРС-%16 1 2 18 27 30 84 18 12 2266 47864 00 47 30 28 25 92 00 00 00 75 53 57