Способ получения комплексного соединения платины (ii) с н днк, обладающего противоопухолевой активностью

(71) Институт физической химии АН УССР им. Л.В.Писаржевского и Киевский государственный институт усовершенствования врачей(56) Блохин Н.Н. и Переводчикова Н,И, Химиотерапия опухолевых заболеваний. М Медицина, 1984, с.95-100.Вестник АМН СССР. 1986, М 12, с,7989.Координационные соединения металлов в медицине. Киев: Наукова Думка, 1986, с.120-174.Авторское свидетельство СССР ЬВ 1754722, кл, С 07 Р 15/00, 1988. Изобретение относится к способу получения нового комплексного соединения платины, обладающего противоопухолевой активностью,Целью изобретения является получение нового платиноорганического комплексного соединения с более высокой активностью и более низкой токсичностью по сравнению с известными противоопухолевыми препаратами.Способ получения полиплатиллена заключается в том, что предварительно нагретые до температуры плавления н-ДНК водные цитратно-солевые растворы цис(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО СОЕДИНЕНИЯ ПЛАТИНЫ (И) С н - ДНК,ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙАКТИВНОСТЬЮ(57) Изобретение касается комплексных соединений пластины (2+), в частности получения комплекса соединения платины (2+) с н-ДНК, обладающего противоопухолевой активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - повышение активности и снижение токсичности целевого продукта, Для этого ведут реакцию цис-дихлордиаминоплатины с дезоксирибонуклеиновой кислотой (выделенной из селезенки крупного рогатого скота, марки А) в присутствии ИаСи цитрата натрия при молярном соотношении 6;4,30:3, при нагревании до 78+0,5 С в течение 15 - 20 мин в водной среде, Полученный продукт обеспечивает 95%-ное торможение роста опухоли при 100-нойвыживаемости животных, 2 табл,дихлордиамминплатины и н-ДНК ют в моля рном соот РсРЯаС:йазСут=6:.4;30:3 и терм ат при этой температуре до око акции. Нативную ДНК растворяют в цитратносолевом растворе (15 ммол ь/л Ма О 1,5 ммоль/л МазСут) при комнатной температуре и нагревают в термостате до Тпл,Цис-дихлордиамминплатину (П) растворяют в таком же цитратно-солевом растворе, предварительно нагретом до температуры плавления н-ДНК.Окончание взаимодействия ДДП и нДН К контролируют спектрофотометрическипо достижению параметров УФ-спектра поглОщвния Айзакс, = 266,2+0,1 нм и Е 266,2=10000+100 л.моль см.Заявляемое вещество получают в водном растворе и в твердом виде как индивидуальное вещество или как смесь сМа С 1+ИазСуэ 5,5 фН 20,П р и м е р 1. Высокомолекулярнуюн-ДНК с температурой плавления 78,0+О,ОСв количестве 0,500 г растворяют при комнатной температуре в 0,375 л водного раствора,содержащего 15 ммоль/л чаС 1 + 1,5ммоль/л НазСу 1 в дальнейшем такой раствор будет называться цитратно-солевым) инагревают раствор с термостате до78,0+0,5 С со скоростью 1 С в минуту,Препарат ДДН в количестве 0,675 г растворяют в 0,375 л цитратно-солевого раствора, предварительно нагретого в термостатедо 78,0+0,5 ОС.Приготовленные растворы н-ДНК иДДП смешивают при 78,0+0,5 С, тщательноперемешивают и термостатируют при78,0+0,5 С еще в течение 15 мин,П р и м е р 2, Опыт проводят как впримере 1, только реакционную смесь подвергают лиофильной сушке по методике изготовления сухой плазмы крови,Раствор полиплатиллена, полученныйпо реакции при постоянном вращении, охлаждают до минус 40 С в течение 40 мин,выдерживают при этой температуре 12 ч, азатем температуру повышают до минус20 С, образец откачивают в течение 40 ч,нагревают до плюс 40 С и снова откачивают26 ч, Полученный после лиофильной сушкилиофилизат представляет собой сложноевещество, состоящее из полиплатиллена,ИаС 1 и йазСу 1 5,5 Н 20 в мольном соотношении Р 1:Р:йаС 1 ЯазСус =- 6:4:30;3,П р и м е р 3, Опыт проводят как в примере 2, только из полученного после лиофильной сушки сложного вещества лиофилизата) удаляют НаС и ИазСу 1 5,5 Н 20. Для этого к 0,250 г лиофилизата добавляют 50 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Полученную известь центрифугируют при комнатной температуре со скоростью 7000 об/мин в течение 15 мин на центрифуге ОПн. Осадок отделяют от надосадочного раствора декантацией, промывают водой, спиртом, эфиром и сушат на воздухе. Сухое вещество хранят при комнатной температуре в закрытой стеклянной посуде. Выход чистого полиплатиллена составляет 607 ь от теоретического. 5 10 15 20 25 30 35 40 50 Для экспериментальной проверки заявляемого способа получения полиплатиллена было проведено еще 22 опыта, 10 из которых показали положительные результаты, В положительных опытах получен продукт, УФ-спектры которого имеют параметры, характерные для заявляемого соединения. Результаты опытов сведены в табл. 1, где приведены характеристики полученных продуктов в зависимости от способа их получения. Способы получения охарактеризованы следующими параметрами; выбором концентрации исходных растворов ДДН и н-ДНК, молярным соотн ошен ием Рс: Р: И а СЛаз С у 1 5,5 Н 20, временем и температурой проведения реак. ции,Из табл. 1 следует, что выбор исходных концентраций ДДН и н-ДНК в пределах ошибки опыта не влияет на характеристики полученного продукта (опыты 1 - 6). Максимальная концентрация ДДН ограничена ее растворимостью, составляющей 0,2523 мас,% при 250 С, Минимальная концентрация ДДП ограничена минимально возможной для хорошей спектрофотометрической регистрации концентрацией н-ДНК, состав ляющей 3,0 мкг/мл. Опыты 7-12 показался, что отклонение от соотношенйя Рс:Р;МаС 1;МазСу 1 в сторону избытка одного иэ компонентов не позволяет получить це. левое соединение полиплатиллен с выше указанными параметрами Уф-спектра,Результаты опытов 13 - 16, указывают что взаимодействие реагентов по реакции протекает быстро и заканчивается за время, не превышающее 5 минут. Увеличение времени термостатирования реакционной смеси до 30 минут не влияет на параметры продукта реакции.Результаты опытов 17 - 22 говорят о существенном влиянии температуры проведения реакции на такой параметр продукта реакции как Е 266,2. Из зависимости Е 266,2 от температуры видно, что для получения заявляемого соединения полиплатиллена термостатирование реакционной смеси надо вести при 78+0,5 С. За пределами указанного температурного интервала нельзя получить продукт с необходимыми па раметрами УФ-спектра.Приведенные лишь данные позволяют заключить, что смешением предварительно нагретых до температуры плавления н-ДНК водных цитратно-солевых растворов н- ДНК и цис-дихлородиаммин-платины (1) в молярном соотношении Рс Р:Ма СМазСус - =6:4;30:3 с последующим термостатированием при этой температуре в течение времени, необходимом для окончания реакции, позволяетполучить соединение, характеризуемое формулой (РсСйНз)(Н 20 Ип- ДНК с ниже- описанными физико-химическими свойствами, Соединение представляет собой биологически активное высокомолекулярное вещество, которое способно эффективно тормозить рост опухоли и увеличивать продолжительность жизни организма при низкой токсичности и тем самым превосходит известные противоопухолевые препараты. 10 Заявляемое вещество, полиплатиллен, существует в растворе и в твердой фазе в виде смеси с хлоридом натрия и цитратом натрия формула цитрата натрияйазС 607 Н 5 5,5 Н 20, сокращенно - йазСус) и как индивидуальное вещество. Смесь полиплатиллена с хлоридом натрия и цитратом натрия представляет собой порошок желтого цвета. Индивидуальное соединение - мелкокристаллический светлокоричневый 20 порошок, Оно устойчиво в растворах и в твердом виде, способно длительное время храниться в воздухе и в холодильнике без изменения свойств, Состав и строение соединения определены нэ основе химико-аналитических и физико-химических исследований твердых образцов и растворов.Элементный анализ соединения в сме 25 си с солями натрия и в.индивидуальном состоянии подтверждает состав синтезированного целевого продукта ролиплатиллена. Для смеси (РсСй Нз)Н 20)6-п-,и-ДНК + Следовательно, в среднем, на 2000 нуклеотидных. квартетов ДНК, состоящих иэ пар аденин-тимин, гуанин-цитоэы, приходится примерна 12000 комплексных частиц РсСМНз)(Н 20) 1+ 30 п йаС+ ЗпйазС 607 Н 5 5,5 Н 20.Найдено, ОД: Рс 20.41: С 22,10; С 11,29; 35й 5,07; Р 1,99; Н 2,06: йа 15,40.Вычислено,: Рс 20,23: С 22,10; С11,83; Й 5,08; Р 2,14; Н 2,19; йа 15,5 .Для индивидуального соединения поли-.платиллена 40Найдено,%: Рс 39,81; О 7,40; С 15,62; й10,11; Р 4,38; Н 2,83,Вычислено, ф: Рс 39,58; О 7,21; С 15.83;й 9,95; Р 4,19; Й 2,67,Измеренная вискозиметрическим метадрм молекулярная масса полиплатилленасоставляет 6,2 106 дальтонав. Рассчитаннаяна основе даиныхо среднестатической молекулярной массе полипропиллена и массыего среднестатической мономерной единицы формулы (среднестатическая величинаи+100)(РсСй НзХН 20)бсС 39 Н 490 эгй 15 Р 4. Полученный в индивидуальном виде полиплатиллен плохо растворяется в воде. Его растворимость повышается в присутствии солей натрия йаС + йазСус). Так при 20 С растворимость препарата в дистиллированной воде составляет всего 0,0005, а в растворе, содержащем 18 ммаль/л йаО и 1,8 ммоль/л йаСус - 0,005. Значительно лучше, чем индивидуальное вещество, раство ряется полиплэтиллен, полученный в смесис йаС + йазСус растворимость такого образца в воде при 2 С равна 0,015. Однако и эта величина на порядок ниже максимально достижимой концентрации соединени 11, полученного в растворе, Пониженная растворимость твердых образцов говорит о необратимой десольватации полиплатиллена при его выделении иэ водного раствора, что обуславливает необходимость использовать суспензии твердых образцов при биологических Испытаниях.Раствор чистого полиплатиллена практически не проводит электрический ток, чта свидетельствует об отсутствии электролити.- ческойдиссоциации при его растворении.УФ-спектры образцов палиплатиллена, полученных в водном растворе и выделенных в твердом виде индивидуально или как смесь с йэС+йазСус, после растворения в ваде характеризуются максимальным поглощением Ямаков. = 266,2 нм, тогда как для свободной н-ДНК смаке. = 258,0 нм. Молекулярный коэффициент поглощения полиплатилленэ в расчете на моль нуклеотида, Е гбь,г= 10000 л см моль, а у н-ДНК - Е 25 з,о" 7000 л,моль см . Смещение максимума поглощения в длинновалнавую область на8,2 нм у полиплатиллена по сравнению с н-ДНК говорит о связывании макромолекулы с плэтйносодержащими группировками в результате образования ковалентных связей между ионом металла и данорными атомами азота оснований ДНК. Более высокая величина длинноволнового смещения УФ- максимума поглощения у полиплатиллена, Ь= 8,2 нм, по сравнению с аналогичной величиной = 7,7 нм для соединения РсОНДНК, свидетельствуето том, чта, в среднем, ковалентные связи между платиной и основаниями ДНК в полиплатиллене прочнее, чем в соединении РсОН-ДНК. Сопровождающий эта связывание гиперхромный эф-фект составляет 30;, указывая на сильные конформационные изменения двойной спирали ДНК при взаимодействии с металлом.,Изменения в ИК-спектрах полиплатиллена па сравнению со свободной ДНК свидетельствуют а том, что металл в нем связывается не только с азотистыми основаниями ДНК, но и с атомами кислорода фосфатных групп. При 1225 и 1060 см находятся полосы вал ентнцх колебанийфосфодиэфирных мостиков ДНК. В области1500-1700 см наблюдаются полосы валентных колебаний С=С, С=И, С=О азотистыхоснований ДНК, в области 3000-3700 см полосы валентнцх колебаний групп С-Н, МН, О-Н, входящих в состав ДНК и молекулводы. Крометого,при 340 см наблюдаетсявалентное колебание РтС 1, при 1340 смдеформационное колебание координиро-.ванной. молекулы ИНз.По данным термического анализа чистый полиплатиллен не теряет молекулу водыдаже при нагревании до 200 С, что свидетельствует о ее прочном связывании. Смесьполиплатиллена с йаС 1+ МазСут 5,5 Н 20 припрогревании до 200 С теряет кристаллизационную воду цитрата натрия, Найдено, чтопотеря воды для смеси полиплатиллен +1 чаС + ЙазСу 1 5,5 Н 20 составляет 5,10 , а. вычисленное количество кристаллизационной воды равно 5,13 .Спектры отражения твердого полиплатиллена имеют значения коэффициентовспектрального отражения, В, , в экстремальных точках, отличие от значений В дляДДП, Для смеси полиплатиллен + йаС 1 +йазСут 5,5 Н 20 В 267,1 = 8,97; Вззз=26,28; в товремя как для ДДП В 2 а,2= 9,7, Вгк,7=13,6;Вззз,з = 10,4; Вз 4 о = 17,10: Ва 4;8=14,80; В 5 и,4- 50,57,Спектры отражения подтверждают, чтополиплатиллен представляет собой вещество, содержащее комплекс платины. составкоординационной сферы которого измененза счет замещения одной молекулы аммиакаи одного аниона хлора молекулой водь ифрагментами ДНК. Данные элементногоанализа, вискозиметрии, кондуктометрии,Уф- и ИК-спектров поглощения, а такжеспектров отражения свидетельствуют о том,что синтезированное соединение действительно высокомолекулярное вещество - поли(гексакис(хлороамминакваплатина(П-дезоксирибонуклеат формулыЯРС 1(ИНз)(НО)Щп-/-ДН К8 табл. 2 представлены результаты испытаний токсичности и противоопухолевойактивности заявляемого соединения и соедйнения РтОН-ДНК, выбранного в качестве. базового. Опыты проводили на мышах икрысах обоего пола разведения питомника"Столбовая"Токсичность изучали на группах животных из половозрелых нелинейных мышейвесом 30,0+2,0 г, прошедшихкарантин 20дней (в каждой группе было по 10 животных), Препараты вводили внутрибрюшинно трехкратно с интервалом в два часа по 0,5мл, Для инъекций РсОН-ДНК использовали5 водные растворы, а для инъекций полиплатиллена - цитратно-солевые растворы (водный раствор, содержащий 15 ммоль/л йаСи 1,5 ммоль/л МазСут) или водные суспензииего твердых образцов, представляющих со 10 бой индивидуальное вещество или егосмесь с МаС 1+ ИазСут.Суммарные дозы препаратов составляли 34,0, 68,0, 84,0, 102,0 и 136,0 мг/кг. Количество погибших животных в каждой группе15 отмечали через каждые 24-48 часов расчеттоксичной дозы, ЛД 5 о, проводили по методике. Летальную дозу, ЛД 1 оо, определялиэкспериментально.В результате проведенных опытов уста 20 новлено, что для соединения РтОН-ДНКЛД 5 о = 66,0, ЛД 5 о = 100 мг/кг. Токсичностьполиплатиллена зависит от формы его введения. Для препарата, полученного в растворе, ЛД 5 о = 102,0, а ЛДоо = 136,0 мг/кг;25 для препарата, выделенного индивидуальноили в смеси с МаС + МазСут 5,5 Н 20 = 82,5,ЛД 5 о = 120,0 мг/кг, Из сравнения приведенных величин следует, что токсичность полиплатиллена значительно ниже, чем у30 соединения РтОН-ДНК. Особенно сниженатоксичностьу полиплатиллена. полученногов растворе,Согласно гистологическим исследованиям гибель животных, получавших токси 35 ческие дозы препаратов обусловленаэнтеротоксичностью. Имеет место выраженная дисплазия клеток эпителия в кишечн.ике, нарушение его регенераторнойфункции, сокращение количества митозов.40 Незначительные изменения отмечены впочках: небольшой отек стромы. зернистаядистрофия канальцев, мелкоочаговые кровоизлияния.Противоопухолевую активность каждо 45 го из препаратов оценивали из экспериментов, проведенных на пяти группах животных(в каждой группе по 10 животных), Белымбеспородным крысам весом 150-200 г подкожу бедра трансплантировали 2 10 - 2850 10 клеток перевивного штамма лейкозаШвеца. Животные 1 группыслужилидля контроля, 11 группа получала соединение РтОНДНК, Ш - полиплатиллен, полученный в,растворе,1 Ч- полиплатиллен, полученный в55 смеси с ИаС 1+Иа Сут 5,5 Н О, Ч - полиплатиллен, полученный в индивидуальном виде, Препараты вводили внутрибрюшиннотрехкратно на 4-6 сутки после трансплантации опухоли, т,е. в период логарифмической фазы ее роста, второй и третий раэ - с интервалами 24-48 ч соответственно, Суммарные дозы препаратов составляли 27,3 мг/кг в расчете на чистый препарат.Противоопухолевую активность оценивали по следующим физиологическим показателям:- по объему опухоли, Ч (смз);- по степени угнетения роста опухоли (ТУС, %),- выживаемости животных на 10-е сутки (вж, О );- продолжительности жизни животных (ПЖЖ, сутки).Расчеты производили по следующим формулам:д за 1+аг+аэ2 3где а 1, а 2, аз - три взаимно-перпендикулярных измерения опухолевого узла;Чкон чоп, 00Чконгде Чкон и Чоп - объем опухоли в контрольной и опытной группах соответственно;А 100вж =где А - число животных на 10-е сутки после трансплантации опухоли,И - число животных в данной группе.ПЖЖ определяли по числу суток, прошедших от момента перевивки опухоли до гибели последнего животного в данной группе, Данные о биологической активности полиплатиллена. приведенные в таблице, подтверждены актом испытаний противоопухолевой активности и токсичности,Анализ данных, представленных в табл.2 показывает, что препарат Р 1 ОН-ДНК по сравнению с контролем тормозит рост опухоли на 940 . Его применение позволяет получить 100%-ную выживаемость животных. В то же время продолжительность жизни животных при его применении уменьшается на 3-е суток по сравнению с контролем, т,е. с нелеченными животными. Противоопухолевая активность полиплатиллена не зависит от формы ведения препарата. Во всех случаях он тормозит рост апухоли на 95 о , обеспечивает 100%-ную выживаемость животных. В то же время продолжительность их жизни увеличивается по сравнению с контролем на 7-8 суток; а по сравнению с Р 1 ОН-ДНК - вдвое, т.е. на 10+1 суток.Сравнительный анализ данных, приведенных в таблице, позволяет заключить, что заявляемое соединение, полиплатиллен,менее токсично, чем препарат РОН-ДНК,особенно если его применять в виде препарата, полученного в растворе, По уровнюпротивоопухолевой активности и выживае 5 мости не уступает соединению РтОН-ДНК, апо такому показателю, как продолжительность жизни, существенно превосходи его,так как увеличивает продолжительностьжизни в два раза,10 Таким образом, создание высокомолекулярного соединения платины (1) с ДНК,полиплатиллена, привело к получению вещества более эффективного, чем известныепротивоопухолевые препараты, так как по15 показателям физиологической активности,характеризующим его противоопухолевыйэффект, предлагаемый препарат превосходит или сопоставим с известными веществами и выгодно отличаается от них из-за20 уменьшения токсичности.Выявленный комплекс свойств: высокие показатели степени торможения ростаопухоли, выживаемости животных и продолжительности их жизни при одновременном25 снижении токсичности делает предложенное соединение перспективным для созда-.ния препаратов, эффективных для лечениязлокачественных опухолей,Дополнительным преимуществом пред 30 лагаемого противоопухолевого веществаявляется обеспечение им возможности расширить ряд высокомолекулярных платиносодержащих протиеоопухолевыхпрепаратов и тем самым обеспечить пре 35 одоление эффекта привыкания организма кплатиновым противоопухолевым средствам.Способ обеспечивает также получениевещества в растворе и в твердой фазе как40 индивидуального соединения в чистом видеи как смеси его с хлоридом и цитратом натрия.Формула изобретенияСпособ получения комплексного соеди 45 нения платины И) с н-ДНК, обладающегопротивоопухолевой активностью, взаимодействием цис-дихлордиаминплатины с. дезоксирибонуклеиновой кислотой, выделенной из селезенки крупного рога 50 того скота, марки А при нагревании до78,0+0,5 ОС в водной среде, о т л и чающ и йс я тем, что, с целью получения соединенияс более высокой активностью и более низкой токсичностью, процесс проводят в при 55 сутствии хлористого натрия и нитратанатрия при молярном соотношении платины, фосфора, н-ДНК, хлористого натрия ицитрата натрия равном 6:4:30;3 в течение15-20 мин.Характеристика пол ченного.п о кта Опыт Характеристика способа Е 266.2 л, моль см14 1813089 13 Таблица 2 Погруппе Погруппеживотных(вве- животных Погруппе животных (контроль) Показатель дено РтО Н-Д Н К)0,70+0,03 0,73+0,03 0,75+0,03 1,00+0,05 15,00+0.75 Степень торможения рос 95 95 95 94 та опухоли,Т/С, %100 100 100 100 100 2 1,0+ 1,0 2 1,0+ 1,0 2 1,0+1,0 1 1,0+1,0 1 4,5+0,5 Составитель О.СмирноваТехред М.Моргентал Корректор О.ГустиГ Редактор Заказ 1589 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Введенная доза,мг/кг Токсическаядоза,ЛДю,мг/кг Летальная доза, ЛД 1 оо,мг/кг Выживаемость, ОПродолжительность жизни, с ки