Способ активации тканевого активатора плазминогена (его варианты)

(72) Райнер Рудольф, Штефан фишери Ральф Маттес (ПК).(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использованодля получения активного плазминогена,Целью изобретения является улучшениекачества конечного продукта за счетболее полного восстановления его нативных свойств. Способ активации ткаИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения активного плазминогена.Целью изобретения является улучшение качества конечного продукта эа счет более полного восстановления его нативных свойств.Пример 1.а) ПриготовленЙев".100 г в йЕ, со 11 в 0 ие "гейгасеПе Ъоклеточной массы,1 моль/л трис/НС 1 лажно 1,5 л ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И СЛНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ЯО, 1607689.Р 1) С 12 Н 15/12 2невого активатора плазминогена - ТРА, полученного в результате экспрессии гена йРА в клетках ЕвсЬегдсЫа со 11 и Рвецйошопав рцйЫа, предусматривает проведение реакции реактивации при рН 9-11, концентрации яББа 0,05- 3 ммоль/л и концентрации яЯН 0,1 - 20 ммоль/л. В качестве слабого денатурирующего раствора используют раствор Ь-аргинина в концентрации 0,05- 1 моль/л или мочевины в концентрации 1-4 моль /л, или метилмочевины в концентрации 0,5-3 моль/л, или диметилмочевины в концентрации 0,5- 1 моль/л, или зтилмочевины в концентрации 0,25-0,75 моль/л, или Формамида в концентрации 0,5-5 моль/л, или этилформамида в концентрации 0,5- 5 моль/л, или ацетамида в концентрации 0,5-4 моль/л или бутирамида в концентрации 0,5-1 моль/л. 2 с.и 5 з,п. Ф-лы, 10 табл.1 и 20 ммоль/л ЕДТА гомогенизируют (П 1 га-Тыггах 10 с) и добавляют 0,25 мг/мл лиозима. После 30 мин инкубации при комнатной температуре вновь гомогенизируют и охлаждают до 3 С. Разложение клеток осуществляютпутем дисперсии при высоком давлении (550 кг/см ), Затем проводятйпромывку 300 мг/л 0,1 моль/л трис/ /НС 1 (рН 6,5) и 20 ммоль/л ЕДТА, После центрифугирования (2 ч для 27000 я, 4 С) грайулы вводят в20 Выход готового продукта в пересчете на количество йРА примерно 1 2%1,3 л 0,1 моль/л трис/НС 1 (рН 6,6),20 ммоль/л ЕДТА и 2,5%. тритон-Х"100и гомогенизируют. После повторног оцентрифугирования (30 мин для27000 я, 4 С) гранулы вводят в 1,3 л0,1 моль/л трис НС 1 (рН 6,5),20 ммоль/л ЕДТА и 0,5% тритон-Х и гомогенизируют. Чередование цен"трифугирования (30 мин для 270008,4 С) и гомогенизации гранул в 1 л0,1 моль/л трис/НС 1 (рН 6,5) и20 ммоль/л ЕДТА проводят еще трижды.Содержание гРА "гейгасгПе Ьой 1 ея"определяют по 808-РАСЕидентификацию 15РА-полос по Меягдгп-Ь 1 огСп" денситометрическим анализом "КеГгас 11 е Ьойхея" по 808-РАСЕ и"Меяг 1 гпЬ 1 о 1 гЫ 8".Анализ показывает плотную гРАполосу с мол. весом около 60 кДт.Доля СРА в общем содержании протеина "гейгас 1 Пе Ьойхея" составляетоколо 21%.б) Растворение/восстановление 25(30 мин для 35000-50000 я., 40 С).Величину рН надосадочной жидкостиустанавливают концентрированной соляной кислотой до рН 3. Денатурирующее1средство и восстановитель отделяютдиализом против 0,01 моль/л НС 1при 4 С,40в) Повторное окисление/активация.Повторное окисление/активациюпроводят 1:50 - 1:200 разбавлением445буфером 0,1 моль/л трис/НС 1 (рН 10,5),1 ммолы л ЕДТА, 1 мг/мл ВЯА,. 0,5 моль/л 1 -аргинина, 2 ммоль/лСЯН, 0,2 ммоль/л СББС.После 17-24 ч активации при 20 Сопределяют активность в сравнении50с активностью естественного гликолизированного ТРА из эвкарионтов,Выход готового продукта в пересчете на общее содержание протеина552,5+0,5%, стимулируемость 10+ 5.Та блица 1 Выход, % Стимулируемость (коэффициент) СББС,ммоль/л О 0,13 1,49 1,28 1,04 0,98 1 у 77 О 0,2 5 6 7 9 10 15 4,0 7,4 5,4 5,8 6,2 10,0 Выход активного РА в пересчете на общее содержание протеина "геГгасг.11 е Ьойез". г) Повторное окисление/активация без отделения денатурирующее средство/в осстановитель .Белок инкубируют при концентрации 1,25 мг/мл в 0,1 моль/л трис/НС 1 (рН 8,6), 6 ммоль/л гуанидингидрохлорида, 0,2 моль/л ДТЕ и 1 моль/л ЕДТА в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем сразу же проводят повторное окисление 1:100 разбавлением в 0,1 моль/л трис/НС 1 (рН 10,5) 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл ВБА,О,З моль/л 1,-аргинина и в указанных в табл, 1 количествах СББС, Дополнительно в активирующей добавке находится остаточная концентрация 0,06 моль/л гуанидингидрохлорида и 2 ммоль/л ДТЕ.Зависимость выхода активаций от СБЯС-концентрации при активации без отделения денатурирующее средство/ восстановитель показана в табл. 1.П р и м е р 2. Около 5 мг белка инкубируют в 1 мл 0,1 моль/л трис/НС 1 (рН 8,6), 6 моль/л гуанидингидрохлорида и 0,15-0,2 моль/л ДТЕ в течение 2-3 ч при комнатной температуре, Не- растворенный материал (фрагменты стенок клеток и т.д.) отделяют центриФугированием (20 мин при 17000 я), Денатурирующее средство и восстановитель удаляют гелевой фильтрацией через ЯерЬайех С. 25 в 0,01 моль/л НС 1, При этом проба разбавляется на коэффициент 5-10, Восстановленный материал растворяют в 0,01 моль/л НС 1 при -20 С.5160768П р и м е р 3. В табл. 2-15 покавано влияние различных параметровна активацию и стимулируемость СРА.Для эксперимента повторного окисления восстановленный протеин, раство 5ренный по примеру 2, больше. не очи-,, щают.Восстановленный протеин (в0,01 моль/л НС 1) активируют растворением 1:10 - 1:500 в буфере повторФного окисленияАктивацию определяют после 22-48 ч,инкубации при комнатной температуре. Активация окисленного повторно протеина по отношению к стандартному повторному окислейию ( 100 Х) в О,1 моль/л трис/НС 1(рН 1 0,5) + 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/лЬ-аргинина, 1 мг/мл ВЯА, 0,5 моль/лСЯН (восстановленный глютатион), 200,5 ммоль/л СБЯС (дисульфид глютатиона).1. Зависимость выхода активации отдобавки Ь-аргинина или гуанидингидрохлорида. 25Повторное окисление в 0,1 моль/л,.трис/НС 1 (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА,1 мг/мл Ь-аргинина, 0,5 ммоль/л ВЯА,0,5 ммоль/л СЯЯС,Зависимость выхода активации от 30концентрации Ь-аргинина представлена в табл. 2.Та блица 2Ь-аргинин, Ак тив нос ть Стимулируе моль/л мость (коэффициент)1 591,5 1262 1622,5 1413 724 12Зависимость активации от добавки метилмочевиныфИетилмочевина Активность,моль/л й 0,5 22 1 174 1,5 313 2 375 2,5 332 3 215Зависимость активации от добавки этилмочевины:Зтилмочевина Активность,моль/л Й 46212,323 0,511,5 2 3002,5 107Зависимость активации от добавки диметилмочевины представлена в табл. 3. Та блица 3 Зависимость активации от добавкимочевины следующая фМочевина Активность,моль/л Х981002723 0,250,50,751,0 7,521,916,33,5 Актив нос ть, (7) 0,25 22 0,5 53 0,75 58 2, Зависимость активации от добавки мочевины и производных мочевины. Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/НС 1 (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА,1 мг/мл ВЯА, 5 ммоль/л СЯН,. 0,2 ммоль/л СББС.Зависимость выхода активации от концентрации гуанидинхлорида следующая 3Гуанидинхлорид,моль/лДиметилмо- Активность, Стимулируечевина, 4 мость (коэфмоль/л фициент) 50 Э. Зависимость активности от добавки амидов жирных кислот.Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/НС 1 (рН 1 0,5) 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл ВЯА, 5 ммоль/л СБН, 0,2 ммоль/л СЯЯС,Зависимость активации от добавок формамида: 0,514522,534 167 256 283 177 78 23 4 8,8 8,9 9,4 77 8,9 9,9 8,6. 1607689 Формамид, Активность,моль/л %0,5 591 1751,5 2452 3252,5 4233 4444 4165 341Зависимость активации от добавокметилформамида:Метилформамид, Активность,моль/л % 1.-аргийийа, 1 мг 7 мл 3 А, 0,5 ммоль/л СБН, 0,5 ммоль/л СВБС.Зависимость активности от величины рН представлена в табл,4,1. а б л и ц а 4 рН Активность, Стимулируемость % (коэффициент) 13,6 20,3 21,3 89 105 959 10 11 5. Зависимость выхода активностиот СБН/СВБС концентрации.Повторное окисление в 0,1 ммоль/лтрис/НС 1 (рН 1 0,5), 1 ммоль/л ЕДТА,0,5 ммоль/л 1.-аргинина, 1 мг/мл ВВА.а) 1 ммоль/л СБН.Зависимость активности от концент 25 рации СВН представлена в табл. 5. Активность, % Таблица 5 СБН, Активность, Стнмулируемость30 (коэффициент) 0,511,522,53 72 134 207 261 204 237 14,9 15,3 13,3 12,5 2,1 239 273 193 198 17О 0 0,1 0,2 0,5 355 10 20 4 1985 141Зависимость активации от добавок пропионамида:Пропионамид, Активность,моль/л % б) О, 2 ммоль/л СБВС.зависимость активности от концентрации СВБС представлена в табл. 6. Та блица 6 Активность, Стимулиру% мость (коэффициент) СББС,ммоль/л Активность, %. 0,5 551 524. Зависимость выхода активности от величины рН.Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/НС 1, 1 ммоль/л ЕДТА 0,5 моль/л 0,511,522 р 5345Зависимостьацетамида:Ацетамид,моль/л 0,511,522)534ЗависимостьбутирамидафБутирамид,моль/л 100135304389466452425121активации от добавок 95 99 197 150 101 39 2 активации от добавок(табл. 17).Воспроизводимость результатовУ активации ТРА,ЯЯС представлена втабл. 8. П р и м е р 4. Активация СРА смешанными дисульфидами :РА и глютатиона.Использование "гейгасд 1 е Ьойдевполученных по одному из предыдущихпримеров, Восстановление "геГгасШеЬой 1 еа" проведено за 2 ч инкубациипри комнатной температуре в 0,1 моль/л,трис/ЧС 1 (рН 8,6),ммоль/л ЕДТА,6 моль/л Ып НС 1, 0,2 моль/л ДТЕ приконцентрации протеина около 1 мг/мл.Диализированный 0,0 мл/л НС 1,восстановленный протеин разбавляют всоотношении 1:1 0,1 моль/л трис/НС 1,рН 9,3, 9 моль/л мочевины и 0,2 моль/лСЯЯС и инкубируют 5 ч .при комнатнойтемпературе.После подкисления концентрированной соляной кислотой до рН Э проводятдиализ 0,01 моль/л НС 1 при.4 С. После диализа общая концентрация протеина составляет 0,35 мг/мл, Таким образом получают РАЯЯС.а) рН - оптимум активации гРАЯБС. 25Здесь, как и в последующих экспериментах по оптимизации условной реактивации, не применяют СЯЯС и активацию проводят через 17 ч путемразбавления в О, моль/л трис,ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л Ь-аргини"на, 1 мг/мл ВБА и 1 ммоль/л СЯН приизменении величины рН (табл, 7). Таблица 8 8,65 4,47 4,49 8,50 -,45 4,32 3,29 3,54 5,072 3 5 6 7 8 9 Средняя величина 7,0 9,3 9,7 6,5 7,2 8,3 14,0 13,4 16,4 5,+1,9 11,3,8 в) Стабильность активированногопротеина.Активацию проводят в 1:200 разбавлении в О, моль/л трис/НС 1,ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л Ь-аргинина,мг/мл ВБА и 2 ммоль/л СЯН.Данные о стабильности активированного протеина приведены а 35 табл. 9. Таблица 7 Та блица 9 рН Время 40 1 6 23 47 451,35 11,4 15,5 23,1 23,6 21,5 22,6 14,3 5,66 7,32 8,65 8,59 8,326,15 3,07 7 ю 8,2 7,0 8,7 11,7 12,5 11,2 7,5 8 8,5 9 9,51010,5 Выход, 7 Стимулируе- мость Выход готового продукта определен по проценту активности йРА впересчете на введенное количествопротеина,б) Воспроизводимость результатовактивации РАЯБС.Все данные активации суммируют;после 1:00 или 1:200 Разбавленияв 0, моль/л трис/НС 1 (рН 8,5),Выход, Х Стимулнруе- мость Выход, Х Стимулируемость00,892,432,832,622,212,28 П Р и м е р 5. Активация полученного генной технологией интерферона-.Восстановление/растворение проводят следующим образом: осадок инкубируют Э ч при 25 С в 10 мл 9,1 моль/л трис/НС 1 (рН 8,6), 6 моль/л Ип НС 1, 1 имоль/л ЕДТА и 0,2 моль/л ДТЕ и после 30 мин центрифугирования при 4 ОС и 48000 я величину рН надосадоч1607689 12Элюат разбавляют 1:50 буфером0,1 моль/л трис/НС 1 (рН 8,5),1 ммоль/л ЕДТА и 0,25 моль/л Ь-ар"гинина и пробу исследуют после 17 чактивации при 0 С.Зависимость активации от добавкиСЯН/СВБС представлена в табл. 10. ной жидкости устанавливают концентрированной НС 1 около 3, Затем проводятгелевую фильтрацию через БерЬа(1 ехС 25 в 0,01 моль/л НС 1,Элюат исследуют на .проводимость,концентрацию протеина и реактивируем,ос тьАктивацию повторно окисленногопротеина определяют по стандартнойактивации (= 100%) в 0,1 моль/лтрис/НС 1 (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА,5 ммоль/л СЯН, 0,5 ммоль/л СББС и0,25 моль/л Ь-аргинина,а) Зависимость выхода активацииот добавки Ь-аргинина.Элюат разбавлен 0,1 моль/л трис/НС 1 (рН 8,5), 1 ммолв/л ЕДТА,5 ммоль/л СББС и активирован 20 чпри 0 С.Зависимость активации от 1.-аргинина следующаяЬ-аргинин, Ак тив ность,моль/л %0,25 Таблица 1 О 0,5 ,0 5 0,5 0,5 10 20 5 5 5 5 0,5 1,0 13 6855актива ии д) Зави от добавкЭлюат р 0,1 мо / 1 ммоль/л 0,5 ммоль/ гинина и и вации приЗависим ВВА: актив ац от добавки Ак тив нос т%13100200100 очевина,моль/л БА г/мл Активность 0,5 1 0,75 1б) Зависимость выхода Ц от добавки мочевины.Раствор активации соответство раствору по пункту а), однако ако вацию проводят 17 ч при 0 С.Зависимость активации от доба ки мочевины: ЯН/СБЯС, Зависимость. Ак тивностьмоль/л активации, %ммоль/л симость выхода иии ВБА.азбавляют 1 ф 50 буферомл трис/НС 1 (рН 8,5),ЕДТА, 5 ммоль/л СБН,л СБВС и 0,25 моль/л 1.-арсследуют через 17 ч актиООС;ость активацииость выхода актива обь пр ива тивации от Зависимость выхода асбавки формамидафформамиц Акмоль/л тив нос ть 7 2 3 г) Зависимость выхода активат окислительно-восстановительнуфера. в) Зависимот добавки ф Активация исследуют по рмамида. как в пунк ле 17 ч ак 13 13 13/л 1.-аргинина и исследоч активации при 0 С.симость активации от в л ЕДТА, уют че" 50 ны рН: тивность рН 1 мо 5 ммол рез 17 Зав1607689 14 13 Формула изобретения Составитель Т. ЗабойкинаТехРед Л.Сердюкова КоРРектоР М.ШаРоши Редактор И, Циткина Тираж 493 Подписное Заказ 3556 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035,;1 осква, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 1. Способ активации тканевого активатора плазминогена,.включающий экспрессию гена СРА в клетках ЕвсЬег 1 сЬда,со 1 или Рвеийощопаз раСЫа, включающий суспендирование и разрушение бактериальных клеток в буферном растворе, отделение нерастворимых составных частей, салюбилиэацию в растворе, содержащем 6 моль/л гуанидинхлорида в присутствии 0,15" 0,2 моль/л РТЕ, очистку с отделением денатурируюшего средства и восстановителя, реактивацию в слабом денатурирующем растворе путем обработки окисленной " яЯЯе и восстановимой- ЕБН, о т л и ч а ю ш и й с я тем, что стадию реактивации осуществляют при рН 9-11, при концентрации яЯЯя 0,05-3 ммоль/л и концентрации БАЯН 0,1-20,0 ммоль/л, а в качестве слабого денатурируюшего раствора используют раствор Ь-аргинина в концентра ции 0,05-1,0 моль/л, или мочевины в концентрации 1-4 моль/л, ипи метилмочевины в концентрации 0,5-3,0 моль/л, или диметилмочевины в концентрации 0,5-1,0 моль/л, или этилмочевины в концентрации 0.25-0,75 моль/л, или формамида в концентрации 0,5- 5,0 моль/л, или этилформамида в концентрации 0,5-5,0 моль/л, или ацетамида в концентрации 0,5-4,0 моль/л, или бутирамида в концентрации 0,5- 1,0 моль/л. 2. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что стадия реакти" 40вации концентрации - яЯН составляет0,2-10,0 ммоль/л и/или концентрацияеЯЯНЕ О, 05-1, О моль/л,3, Способ по п.1 или п.2, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что перед реактивацией проводят дополнительную стадию очистки е4. Способ по п. 1 или п.2, о т л и -ч а ю щ и й с я тем что реактивацию проводят в присутствии денату"рируюшего средства и восстановителя, при этом реакционную смесь после процедуры денатурации - восстановителя разбавляют буфером реактивации так, чтобы при последующейреактивации концентрация ЕЯЯЕ превосходила остаточную концентрациюДТЕ.5. Способ активации тканевого активатора плазминогена, включающийэкспрессию гена 1 РА в клетках ЕзсЬегсМа со 1 д или Рзеойошопаз рийЫа,включающий суспендирование и разрушение бактериальных клеток в буферном растворе, содсржашем 6 моль/лгуанццинхлорида в присутствии 0,50,2 моль/л ДТЕ, очистку с отделениемденатурирующего средства и восстановителя с последующей реактивацией,о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтопосле отделения гуанидинхлорида белокпереносят на смешанный дисульфид инкубацией с яЯЯЕ при концентрации0,1 моль/л в присутствии 4,5 моль/лмочевины, а реактивацию проводятпри рН 7-10,5 путем обработки яЯНв концентрации 1-3 ммоль/л в присутствии 0,5 моль/л Ь-аргинина,6. Способ по и, 5, о т л и ч аю щ и й с я тем, что стадию реак-.тивации проводят в сывороточном альбумине ВЯА.7. Способ по п 1 или п. 6,о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтосуспендирование и разрушение бактериальных клеток проводят в 0,1 Итрис-буферном растворе с рН 6,5,