Способ подготовки мозговой ткани к исследованию секреции медиаторов

0 подвесного штатива-встряхивателя 18,15имеющего восемь гнезд диаметром 20 мми одно гнездо диаметром 50 мм для общего объема, в котором одновременноинкубируют четыре образца ткани, заключенные в держатели, а также изОпробирок 19 диаметром 15-20 мм и высотой 40 :м для инкубации сред, в которые помещают держатели 20 образцов.Блок термостатирования (фиг.3),25предназначенный для термостатирования образцов ткани, инкубационныхсред, состоит из двух термостатов 1 вдля гемокоагуляции - ТПС, В серединеванны 21 первого термостата подвеской 22 прикрепляют свободно качающийся штатив-встряхиватель 23 длиной155 мм, шириной 55 мм и высотой .40 мм, Подвеску 22 прикрепляют нижнимконцом к нижней пластине штатива 23,При этом длина подвески составляет35 80 мм, Справа, на корпусе термостата,прикрепляют мотор 21 с шатуном 25 длявстряхивания штатива. Мотор прикрепляют к корпусу термостатакронштейном 26, к которому и крепят при по 4 О мощи длинного болта и гаек подвеску22. Вторую подвеску штатива с противоположной стороны прикрепляют ккорпусу ванны также при помощи крон"штейна, болта и гаек. Блок содержит45 также контактный 27 и измерительный28 термометры и мотор 29 для перемешивания жидкости в ванне,Автоматическую подачу инкубационных сред осуществляют двумя автома 5 б тическими дозаторами 7 а и 7 б, которые предназначены для подачи инкубационных сред фиксированными объемамив инкубационные пробирки 19.Делитель карбогена (фиг.4) пред 55 назначен для равномерного распределения карбогена во все необходимыеузлы и блоки, Ой состоит из сосуда30, наполненного водой для увлажнеИзобретение относится к медицине,в частности к способам исследованиянервной системы, преимущественно процессов секреции биологически активных соединений, 5Цель изобретения - ускорение иповышение физиологичности способа эасчет устранения приемов подготовки,травмирующих ткань, инкубацию и отмывание проводят при рН 7,20-7,35,причем отмывание осуществляют путем10-15-кратного переноса в свежую среду инкубации,Иа фиг.1 показана функциональнаясхема устройства; на фиг,2 - схемадержателей срезов; на фиг. 3 - блоктермостатирования; на фиг,4 - делитель карбогена,Функциональная схема содержит водяные термостаты 1 для исследуемыхобразцов ткани и основных инкубационных сред, держатели 3 срезов, подключенные силиконовыми трубками 3,к выходам делителя 4 карбогена, объемы 5 а и 5 б основных инкубационныхсред, подключенные силиконовыми трубками 6 к выходу делителя карбогена,автоматические дозаторы 7 а и 7 б подключенные силиконовыми трубками 8 кобъемам основных инкубационных сред,и источник 9 карбогена, подключенныйсиликоновой трубкой 10 к делителюкарбогенаТрубки, подающие карбоген(фиг.1), представлены сдвоенными тонкими линиями, а инкубационные средыодинарной жирной.Держатели срезов мозга (фиг,2)предназначены для быстрого переносаобразцов исследуемой ткани из однойинкубационной среды в другую.При помощи алмазной пилки в нижней части полой стеклянной трубки диаметром 10 мм и длиной 70 мм выпиливают под струей воды два окна шириной4-5 мм и длиной 7-8 мм для циркуляции среды 11 инкубации, На 3-4 мм выше окон выпиливают четыре. отверстия12 диаметром 1-2 мм для циркуляциикарбогена, На верхней части стеклянной трубки выпиливают отверстие 13для выхода излишка карбогена. Окнапокрывают нейлоновой сеткой 14 одноразового пользования, которую прикрепляют к корпусу держателя силиконовым кольцом 15Силиконовые трубкиот делителя 16 карбогена фиксируют вдержателе при помощи резиновой пробки 17 на такой высоте, чтобы они не погружались в инкубационную среду при переносе туда держателя. Так как среда предварительно насыщена карбогеном, то карбоген, поступающий в держатель 2 через четыре отверстия в корпусе, полностью вытесняет воздух с поверхности среды инкубации ипрепятствует обмену карбогена, растворенного в среде с воздухом, Такоеподдержание насыщенности среды позволяет использовать одновременно несколько держателей, Полный блок держателей образцов (фиг.2) состоит изз 272250 4ния карбогена, тройника 31, первый торяют 5 - 8 раз (10-6 мин) Дчльвыход которого связан с объемом 5 аинкубационной среды, третий выход - выполняют при добавлении в инкубацис объемом 56 с ер ды деполяризации, онную среду определенной концентрачетверника 32, вход которого связан 5 ции фармакологического агента, Приес вторым выходом тройника 31, а каж- мы Г и Д выполняют также при наличиичдыи из четырех выходов связан с со- в средах той же концентрации агента,ответствующим держателем образцов Возможность практического применеткани, Стрелками указано направление ния изобретения для исследования секдвижения карбогена, Все узлы дели 1 Ореции и влияние фармакологическихтеля соединяются между собой силико- агентов на секрецию биологически ак"новыми трубками. тивных соединений подтверждается слеСпособ осуществляют следующим об- дующими примерами,разом (отдельные приемы осуществле- Пример 1 ДлДля инкубации срения обозначены буквами А, Б, В и 5 зов используют среду В 1;содержащую,т.д.) мМ; аС 1 118; КС 1 4,8; СаС 1 1,3;Образцы ткани, заключенные в дер- МдЯО2 глюкоза 11 1 ЭЛТА 0 004д Ф Ф9 Ф 1 Фжатели, вносят в один стакан, поме- аскорбиновая кислота О 11 а фосфатФ 1щенный на штативе термостата и содер- ный буфер рН 7,25 - 1; ХаНСО - 15;жит среду инкубации, и инкубируют 0 рН 725 при насыщении карбогеномпри 37 С. Все остальные приемы прово- (957 О + 57 СО ). Для деполяризациидят при той же температуре. При ис- срезов используют среду % 2 отлича 1пользовании меченых биологически ак- ющуюся от среды У 1 только содержативных соединений инкубацию проводят нием МаС 1 109,8 мМ КС 1 20 мМв присутствии данного соединения. 25 Четыре тангенциальных среза корыПромывка. А, За 1 мин до оконча- мозга крыс, толщиной 0,3 мм помещаютния времени совместной инкубации об- в четыре держателя, свободно пронуразцов ткани в тот же штатив помеща- мерованных, при этом номер среза соют пробирки (9, фиг,2), которые за- ответствует номеру держателя, и инполняют 2 мл среды инкубации (объем 30 кубируют 10-15 мин в общем объеме,5 а) автоматическим дозатором 7 а.нБ, По истечении времени совмест- Затем в общий объем добавляют 10 ной инкубации держатели помешают каж мкКи Ш-Н -норадреналина НАдЫи в отдельную пробирку и инкубиру- йпегзЬаш, Англия, удельная радиоакют 2 мин. тивность 10-20 Ки/мМ с конечной конВ, Приемы, описанные в А и Б, пов- центрацией 2,5 х 10 М на 1 мл и инторяют 10-15 раз, Использованную ин- кубируют 1 О мин,Первый этап. После инкубированияСекреция, Г, За 1 мин до оконча- . каждый держатель со срезом отдельно,ния промывки новую серию пробирок эа.40 но параллельно, промывают 30 мин вполняют 1 мл среды инкубации, куда среде1, Промывка описана вышепереносят держатели после промывки и (приемь А Б В), 3риемы , , ), атем проводят приник би т 2 мин П су Рую о ле этого приема емы спонтанной и вызванной секрецийинкубационную среду сохраняют для.ко- (Г,Д) с использованием сред В 1 и 2.личественного исследования - спонтан 45 Второй этап, После исследованияная секреция, Д, За 1 мин до оконча- секреции срезы промывают восемь разния спонтанной секреции новую серию 2 мл среды У 1 по 2 мин инкубации,пробирок заполняют 1 мл среды деполя- Затем срезы 1 и 111 промывают 7 раз.ризации (объем 56) автоматическим до мл среды Р 1 по 2 мин инкубапии,затором 76 и переносят туда держате Срезы 11 и 1 Ч промывают параллельноли, инкубируют 2 мин, После этого с 1 и 111 при тех же условиях, но вприема среду также сохраняют для ко- среду инкубации автоматической микроличественного ислледования - вызван- пипеткой добавляют 0,05 мл немеченоная секреция, го НА с конечной концентраций 10 МФармакологический анализ, Для ис за 14 мин до спонтанной секреции.следования влияния фармакологических Спонтанную и вызванную секреции проагентов на секрецию. биологически ак- водят также при концентрации НАтивных соединений приемы А и Б пов М Третийретий, четвертый и пятый127 1,2 + 0,05 1- 810 28,8 + 4,4 4814 + бе 9 б +б 0,0 1 О 7 4,8 + 10 24 +О,(0,01 8,3. Истных корафикКм = 5 Таблосущест при разл с извест этапы полностью повторяют второй стой лишь разницей, что в этих этапахприменяют 1 О , 1 О , 10 М немече8 -8ного НА соответственно.Для исследования радиоактивностииз проб отбирают по 0,2 мл среды идобанлнют в сцинтилляционный флакон,содержащий 1 О мл сцинтиллятора Брея.Радиоактивность пересчитывают в счетчике фирмы Е КВ, На ВеСа и ныражают в распадах в минуту,Определяют интенсивность секреции3/Н - НА Я - вызванная секреция/7спонтанная секреция. Для срезов 1и 111 соответственно Я, = 2,17;1,53; Яд = 1,59; 2,18; Б 1,87;1,62; Я,р = 1,74+0,2; коэффициент вариации С)( = 13,7 Ж (1-5 - номера этапов),При фармакологическом воздействии экзогенного НА (концентрации указаны в скобках) для срезов 11 и Е)/соответственно Б, 1,85; 2,05;Б (О М) = 1,88; 1,99; Яз(10 М)щ=2,53; 2,09; Я (10 М) = 1,51; 1,79;Б (10 М) = 1,21; 1,26.Степень изменения интенсивности секреции в и- м этапе по отношению кпервому Б= Б/Я Для срезов 1и 111 соответственно Б, = 0,73; 1;42;Б = 0,86; 1,13; Я = Ов 67; 1,3;Я = 0,95; 1,06. При фармакологичесДля построения кинетической кривой зависимости от концентрации захвата НА.вычисляют чистый эффект воздействия экзогенного НА двумя спосо бами, Первым способом пересчитывают величину отношения 11/1. Чистый эффект соответствует концентрации НА составляет 10М = 1,2 - 1 = 0,2;10 М = 2,24 - 1 = 1,24, Вторым способом приравнивают отношение 1 к 507. и пересчитывают чистый эффект соответствующей концентрации НА. для отношения 11 : 10(50/2,28) х х 34,6 - 5/ = 10, 1 х 1 О М2250 аких воздействиях экзогенного РАЯ, (НА) = Я(11 А)/Я, для срезов 1 и1)/ соответственно Б, (10 М) " 1,02;0)9 ; Я (10 М) = 1,37; 1)02;=0,65; 0,61, Определяют степень фармакологического влияния исследованных концентраций экэогенного НА наЬинтенсивность секреции Н - НА, Ог= )(я) /(я ),= 0,82/0,67 + 0,87/1,3/2 = 0,92;С(О М) = 0,65/0,95 + 0,61/1,06/20,63. П р и м е р 2. Для определениявысокоаффинного захвата НА вы числяют процентное отношение последующего спонтанного выделения НЪНА СВ, где и = 2-5 к СВ (1-5 - номера этапов), и влияние экзогенногоНА на этиотношения,30 Табл,1 иллюстрирует влияние экзогенного НА на спонтанное выделение3Н - НА из срезон коры мозга крыс винкубационную среду. 45(50/48,8) х 104,8 - 50 =пользуя систему. двойных обординат, получают линейныйвысокоаффинного захвата НА- 1,5 х 10 М.50П ример 3торых параметровопыта, в которыхводили способом Для сравнения неко- было поставлено три промывку срезов проперфузии. иллюстрирует результаты ения предложенного способа ичных условиях в сравненииным е1272250 Таблица 2 Максимальное количество Количество Время исследования одного среза Коэффициент Спонтанная сек реция в зависи мости от степе Колич ество Способ параметров повьппения точ промывок срезов, исследуемыходновременнов одном ни промывки,мкКи ностиспособа опыте Предлагаемый 10 7,25 1223,73,4 1,9 4 1 ч 30 мин 8 2 ч 1 О мин 8 7,3 1080,859,4 2,54 7,35 980,2 Ф 57 2,37 4 2 ч 30 мин 8 ИзвестОт 3 ч 20 мии 1до 4 ч 10 мин 25 иг,1 7,4 2323 +272,4Формула изобретения Способ подготовки мозговой ткани к исследованию секреции медиаторов путем приготовления срезов ткани, инкубации в среде насыщенной карбогеном и отмывания с последующей регистрацией уровня в среде, о т л ич ающий с я тем, что, с цельюускорения и повьвения физиологичности способа за счет устранения приемовподготовки, травмирующих ткань инкубацию и отмывание проводят при рН7,20 - 7,35, причем отмывание осуществляют путем 10-15-кратного переносав свежую среду инкубации.1272250 А. Агуреев анич К оставител ехред М.Х тор В, Бутяга едактор А. Козориэ Подписи Заказ 6334/4 Тираа 778Государственного комитетлам изобретений и открытМосква, Ж, Раущская НИИП б д.4/5 13 оиз твенно-полиграФическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,